Novel Concepts of Mycobacterial Evasion Mechanisms
Luukinen, Hanna (2023)
Luukinen, Hanna
Tampere University
2023
Lääketieteen ja biotieteiden tohtoriohjelma - Doctoral Programme in Medicine and Life Sciences
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Väitöspäivä
2023-03-17
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-03-2745-3
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-03-2745-3
Tiivistelmä
Mycobacterium tuberculosis -bakteerin aiheuttama tuberkuloosi on tällä hetkellä maailman tappavin infektiotauti. Nykyinen tuberkuloosin antibioottihoito on useamman lääkkeen yhdistelmä ja se kestää useita kuukausia, mutta ei siitäkään huolimatta takaa onnistunutta mykobakteerin häätämistä. Tehottomien antibioottien käyttö sekä pitkät hoitoajat keskeytyksineen edesauttavat antibioottiresistenttien kantojen syntyä. Lisäksi turvallisen ja tehokkaan rokotteen puute tekee tuberkuloosin ehkäisemisestä hankalaa. Yksi syy näihin haasteisiin tuberkuloosin ehkäisemisessä ja hoidoissa on mykobakteerin kyky kehittää krooninen infektio ja suojella itseään ympäristöhaitoilta kuten aktiiviselta immuunivasteelta sekä antimikrobiaalisilta lääkkeiltä.
Tämän tutkimuksen tavoitteena on tutkia mykobakteerin mekanismeja, joiden avulla se pystyy estämään antibioottien ja immuunivasteiden tehokkaan toiminnan, sekä etsiä uusia strategioita näihin mekanismeihin puuttumiseen. Mycobacterium marinum -bakteeria ja seeprakalaa käytettiin tutkimaan isännän ja patogeenin välistä vuorovaikutusta. Mykobakteeri kykenee aktiivisesti vaimentamaan immuunivasteita ja myöhästyttämään hankittujen immuunivasteiden alkamista. Tutkimuksessa testattiin immunomodulaation tehoa näiden mykobakteerin ominaisuuksien estämisessä. Ilman hoitoja noin 10 % aikuisista seeprakaloista pystyy luonnollisesti pitämään mykobakteerimäärän alle qPCR:n detektiorajan. Tätä osuutta voitiin kuitenkin nostaa 25 %:iin aktivoimalla immuunivaste lämpötapetulla Listeria monocytogenes -bakteerilla ennen mykobakteeri-infektiota. Aikaansaatu suojaava immuunivaste vähensi merkitsevästi mykobakteerimääriä mitattuna neljä viikkoa infektion jälkeen ja jopa steriloi mykobakteerin osasta populaatiota sekä villityypin kalassa että rag1-/- -mutanttikaloissa, mikä viittaa synnynnäisten immuunivasteiden tärkeään rooliin mykobakteerin steriloivassa vasteessa. Suojaavassa vasteessa mpeg1, tnf ja nos2b -geenien ilmentyminen oli merkitsevästi lisääntynyt, kun taas sod2 oli vähentynyt verrattuna kontrolliryhmään. Nämä tulokset viittaavat mykobakteerin häätämiseen infektion varhaisessa vaiheessa lisääntyneen tulehdusvasteen ja tehokkaamman mykobakteerin tuhoamisen avulla. Huomattavaa on, että immunolodulaatio lämpötapettua L. monocytogenes -bakteeria hyödyntäen ei saanut aikaan suojaavaa vastetta, jos infektio oli jo olemassa. Vastaavaa immuuniterapiaa voitaisiin kuitenkin käyttää ennaltaehkäisevänä menetelmänä korkean tuberkuloosi- ilmaantuvuuden alueilla.
Toinen tutkittu mykobakteerin suojautumiskeino on biofilmin muodostaminen. Immuunivasteiden heikentämisen ja infektion aikaansaamisen jälkeen mykobakteeri muodostaa bakteeriyhteisöjä granuloomissa ja tuottaa solunulkoista matriksia, joka antaa bakteeripopulaatiolle tukea ja suojaa. Nopeakasvuista bioluminoivaa M. marinum -bakteeria käytettiin biofilmin kypsymisen ja koostumuksen tutkimuksessa in vitro. Tulokset osoittivat, että biofilmin kypsyminen ei muuttanut rifampisiinin MIC-arvoa (minimum inhibitory concentration), mutta nosti MBC-arvoa (minimum bactericidal concentration) 63-kertaisesti verrattuna planktoniseen yksisoluisena kasvavaan mykobakteeriin kahden päivän biofilmin kasvattamisen jälkeen. Toistuvilla antibioottialtistuksilla pystyttiin varmistamaan, että biofilmin lisääntynyt antibioottitoleranssi ei johtunut geneettisestä resistenssistä. Elävien mykobakteerien lukumäärää biofilmissä pystyttiin vähentämään hajottamalla solunulkoisen matriksin tärkeimpiä polymeerejä yhdessä rifampisiini-hoidon kanssa, mikä osoitti biofilmin matriksin tärkeyden antibioottitoleranssissa.
Nopea bioluminesenssimittaukseen perustuva tappokäyräanalyysi validoitiin mittaamaan erityisesti persistoivien mykobakteerien alapopulaatiota. Analyysissa seurataan bakteeripopulaation tappokinetiikkaa korkealla antibioottikonsentraatiolla, ja voidaan mitata persisteribakteerien alapopulaatiota, joka kykenee sietämään antibioottia keskimääräistä pidemmän ajan. Tappokinetiikka oli merkitsevästi hitaampi yhden viikon ikäisellä M. marinum biofilmillä verrattuna planktoniseen yksisoluiseen kasvatukseen. Lisäksi rifampisiinin konsentraatio saturoitui 400 μg/ml:ssa, jonka jälkeen antibioottikonsentraation nostaminen ei nopeuttanut bakteerien tappoa. Tätä menetelmää on mahdollista käyttää seulomaan hoitoja, jotka vaikuttavat erityisesti persistoiviin soluihin.
Lopuksi tutkittiin mykobakteerin biofilmin solunulkoisen matriksin proteiineihin, GroEL1 ja GroEL2, kohdentuvia sybodeja in vitro M. marinum ja M. tuberculosis biofilmeissä sekä ex vivo seeprakalan granuloomissa. Sybodit ovat synteettisiä vasta- aineen sitoutumisosaa matkivia molekyylejä, jonka sitoutumista voidaan helposti muokata ja seuloa halutun kohteen mukaan olemassa olevista sybody-kirjastoista. Seulonnasta saatujen potentiaalisten sybodien sitoutumista mykobakteerin biofilmiin arvioitiin konfokaalimikroskopian avulla. Fluoresenssileimatut anti-GroEL-sybodit tunnistivat GroEL-proteiineja biofilmin päältä sekä in vitro että ex vivo tehden sybodista houkuttelevan vaihtoehdon erilaisten molekyylien kohdentamisessa mykobakteerin biofilmeihin. Nykyisiä antibioottihoitoja voidaan mahdollisesti tehostaa ja hoitojen pituutta lyhentää ottamalla huomioon granuloomien sisällä biofilmeissä olevat mykobakteeripersisterit. Ymmärtämällä paremmin mykobakteerin menetelmiä, joilla se suojelee itseään ympäristön haittavaikutuksilta, tulevaisuuden hoitoja voidaan kohdentaa tehokkaammin Mycobacterium tuberculosis -bakteeria vastaan.
Tämän tutkimuksen tavoitteena on tutkia mykobakteerin mekanismeja, joiden avulla se pystyy estämään antibioottien ja immuunivasteiden tehokkaan toiminnan, sekä etsiä uusia strategioita näihin mekanismeihin puuttumiseen. Mycobacterium marinum -bakteeria ja seeprakalaa käytettiin tutkimaan isännän ja patogeenin välistä vuorovaikutusta. Mykobakteeri kykenee aktiivisesti vaimentamaan immuunivasteita ja myöhästyttämään hankittujen immuunivasteiden alkamista. Tutkimuksessa testattiin immunomodulaation tehoa näiden mykobakteerin ominaisuuksien estämisessä. Ilman hoitoja noin 10 % aikuisista seeprakaloista pystyy luonnollisesti pitämään mykobakteerimäärän alle qPCR:n detektiorajan. Tätä osuutta voitiin kuitenkin nostaa 25 %:iin aktivoimalla immuunivaste lämpötapetulla Listeria monocytogenes -bakteerilla ennen mykobakteeri-infektiota. Aikaansaatu suojaava immuunivaste vähensi merkitsevästi mykobakteerimääriä mitattuna neljä viikkoa infektion jälkeen ja jopa steriloi mykobakteerin osasta populaatiota sekä villityypin kalassa että rag1-/- -mutanttikaloissa, mikä viittaa synnynnäisten immuunivasteiden tärkeään rooliin mykobakteerin steriloivassa vasteessa. Suojaavassa vasteessa mpeg1, tnf ja nos2b -geenien ilmentyminen oli merkitsevästi lisääntynyt, kun taas sod2 oli vähentynyt verrattuna kontrolliryhmään. Nämä tulokset viittaavat mykobakteerin häätämiseen infektion varhaisessa vaiheessa lisääntyneen tulehdusvasteen ja tehokkaamman mykobakteerin tuhoamisen avulla. Huomattavaa on, että immunolodulaatio lämpötapettua L. monocytogenes -bakteeria hyödyntäen ei saanut aikaan suojaavaa vastetta, jos infektio oli jo olemassa. Vastaavaa immuuniterapiaa voitaisiin kuitenkin käyttää ennaltaehkäisevänä menetelmänä korkean tuberkuloosi- ilmaantuvuuden alueilla.
Toinen tutkittu mykobakteerin suojautumiskeino on biofilmin muodostaminen. Immuunivasteiden heikentämisen ja infektion aikaansaamisen jälkeen mykobakteeri muodostaa bakteeriyhteisöjä granuloomissa ja tuottaa solunulkoista matriksia, joka antaa bakteeripopulaatiolle tukea ja suojaa. Nopeakasvuista bioluminoivaa M. marinum -bakteeria käytettiin biofilmin kypsymisen ja koostumuksen tutkimuksessa in vitro. Tulokset osoittivat, että biofilmin kypsyminen ei muuttanut rifampisiinin MIC-arvoa (minimum inhibitory concentration), mutta nosti MBC-arvoa (minimum bactericidal concentration) 63-kertaisesti verrattuna planktoniseen yksisoluisena kasvavaan mykobakteeriin kahden päivän biofilmin kasvattamisen jälkeen. Toistuvilla antibioottialtistuksilla pystyttiin varmistamaan, että biofilmin lisääntynyt antibioottitoleranssi ei johtunut geneettisestä resistenssistä. Elävien mykobakteerien lukumäärää biofilmissä pystyttiin vähentämään hajottamalla solunulkoisen matriksin tärkeimpiä polymeerejä yhdessä rifampisiini-hoidon kanssa, mikä osoitti biofilmin matriksin tärkeyden antibioottitoleranssissa.
Nopea bioluminesenssimittaukseen perustuva tappokäyräanalyysi validoitiin mittaamaan erityisesti persistoivien mykobakteerien alapopulaatiota. Analyysissa seurataan bakteeripopulaation tappokinetiikkaa korkealla antibioottikonsentraatiolla, ja voidaan mitata persisteribakteerien alapopulaatiota, joka kykenee sietämään antibioottia keskimääräistä pidemmän ajan. Tappokinetiikka oli merkitsevästi hitaampi yhden viikon ikäisellä M. marinum biofilmillä verrattuna planktoniseen yksisoluiseen kasvatukseen. Lisäksi rifampisiinin konsentraatio saturoitui 400 μg/ml:ssa, jonka jälkeen antibioottikonsentraation nostaminen ei nopeuttanut bakteerien tappoa. Tätä menetelmää on mahdollista käyttää seulomaan hoitoja, jotka vaikuttavat erityisesti persistoiviin soluihin.
Lopuksi tutkittiin mykobakteerin biofilmin solunulkoisen matriksin proteiineihin, GroEL1 ja GroEL2, kohdentuvia sybodeja in vitro M. marinum ja M. tuberculosis biofilmeissä sekä ex vivo seeprakalan granuloomissa. Sybodit ovat synteettisiä vasta- aineen sitoutumisosaa matkivia molekyylejä, jonka sitoutumista voidaan helposti muokata ja seuloa halutun kohteen mukaan olemassa olevista sybody-kirjastoista. Seulonnasta saatujen potentiaalisten sybodien sitoutumista mykobakteerin biofilmiin arvioitiin konfokaalimikroskopian avulla. Fluoresenssileimatut anti-GroEL-sybodit tunnistivat GroEL-proteiineja biofilmin päältä sekä in vitro että ex vivo tehden sybodista houkuttelevan vaihtoehdon erilaisten molekyylien kohdentamisessa mykobakteerin biofilmeihin. Nykyisiä antibioottihoitoja voidaan mahdollisesti tehostaa ja hoitojen pituutta lyhentää ottamalla huomioon granuloomien sisällä biofilmeissä olevat mykobakteeripersisterit. Ymmärtämällä paremmin mykobakteerin menetelmiä, joilla se suojelee itseään ympäristön haittavaikutuksilta, tulevaisuuden hoitoja voidaan kohdentaa tehokkaammin Mycobacterium tuberculosis -bakteeria vastaan.
Kokoelmat
- Väitöskirjat [4945]