Development of three-dimensional liver hydrogel with sacrificial support

Abstract

For a long time, there has been a worldwide shortage of organ donations with hundreds of thousands of people suffering from prolonged waiting times. In addition, the current in vitro platforms for drug development and modelling of diseases, require a rapid upgrade towards more biologically relevant, three-dimensional (3D) systems. Tissue engineering (TE) of 3D scaffolds aims to solve these issues by fabrication of tissues and even organs in vitro with suitable biomaterials and fabrication techniques. 3D printed polymeric structures in combination with suitable biocompatible hydrogels results in 3D hydrogel constructs suitable for TE applications. This thesis work had three aims. First was to develop a 3D printed PVA mesh. Second aim was to prepare a robust, optimally crosslinked liver dECM hydrogel. And the third aim was to combine the mesh and the hydrogel into a cell culturing platform for liver hepatocytes. At first, a 3D model was developed, according to which a 4-layer PVA mesh was 3D printed. The solubilization kinetics of the mesh in phosphate buffer saline (PBS), were determined by measuring the diffraction over time. Full dissolution was observed within 180 min. Next, the dECM hydrogel was prepared form porcine liver and the decellularization deemed successful as over 99 % of the DNA was removed in relation to native liver. From the dECM, 4 different hydrogels with varying degrees of crosslinking were prepared: non-pH adjusted, pH adjusted, one crosslinked with succinimidyl valerate-polyethylene glycol-succinimidyl valerate (SVA-PEG-SVA), and one with crosslinkers SVA-PEG-SVA and tyrosinase. The addition of crosslinkers SVA-PEG-SVA and tyrosinase led to highest degree of crosslinking, confirmed with Trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) assay. With scanning electron microscopy (SEM), the effect of crosslinking on the gels’ porosity was determined, with denser porosity observed with higher degree of crosslinking. Viscosity and gelation kinetics of the hydrogels were determined by rheological measurements. These results were in line with TNBS-, and SEM results, with higher viscosity associated to higher degree of crosslinking. Additionally, all gels presented shear thinning. The gelation kinetics results showed that the addition of SVA-PEG-SVA and tyrosinase induced the slowest overall crosslinking. For the cell viability studies, liver HepG2 cells were encapsulated into the SVA-PEG-SVA and tyrosinase crosslinked hydrogel, and casted over the PVA mesh. The viability of the HepG2 cells was determined with Live/Dead assay and with alamarBlue assay. Both assays provided results of increased cell viability and proliferation. AlamarBlue assay showed exponential increase of viability between days 1 and 7, supported by the findings form Live/Dead assay. In this thesis, TE methods were deployed to develop a cell culture platform from liver dECM hydrogel with integrated 3D printed PVA mesh. The effect of additional crosslinkers on the dEMC gel were determined for optimal composition and properties. The platform was observed to support HepG2 cell proliferation over 7 days period.

Maailmanlaajuisen elinluovutuspulan vuoksi sadat tuhannet ihmiset kärsivät pitkittyneistä odotusajoista. Myös lääkekehitys ja sairauksien tutkiminen vaativat nopeaa kehitystä kohti kolmiulotteisten (3D) biologisesti relevanttien in vitro-kudosmallien käyttöä. Kudosteknologian avulla näihin ongelmiin voidaan tarjota ratkaisuja valmistalla in vitro-ympäristössä kudoksia matkivia 3D-rakenteita ja tulevaisuudessa jopa elimiä. Tällöin erilaiset biomateriaalit ja valmistusmenetelmät ovat keskeisessä roolissa. Valmistettavien rakenteiden sisäistä ja ulkoista geometriaa voidaan hallita 3D-tulostuksen avulla. Kyseisellä menetelmällä valmistettujen polymeerirakenteiden ja bioyhteensopivien hydrogeelien yhdistelmiä on mahdollista käyttää kudosteknologisissa sovelluksissa. Opinnäytetyöllä oli kolme tavoitetta. Ensimmäiseksi tuli suunnitella ja 3D-tulostaa poly-vinyylialkoholi (PVA)-ristikko. Toisena tavoitteena oli valmistaa optimaalisesti ristisilloitettu hydrogeeli maksan soluttomasta ekstrasellulaarisesta matriisista (dECM). Kolmantena tavoitteena oli valmistaa soluviljelyalusta maksan syöpäsoluille integroimalla PVA-ristikko dECM-hydrogeeliin. Aluksi kehitettiin 3D-malli, minkä mukaan 3D-tulostettiin nelikerroksinen PVA-ristikko, jonka liukoisuuskinetiikka selvitettiin mittaamalla diffraktiota fosfaattipuskurisuolaliuoksessa (PBS). Totaalisen liukenemisen havaittiin tapahtuneen 180 minuutissa. Seuraavaksi dEMC-hydrogeeli valmistettiin poistamalla solut sian maksakudoksesta. Menetelmä todettiin onnistuneeksi, koska yli 99 % DNA:sta oli poistettu verrattaessa natiiviin maksakudokseen. DECM:stä valmistettiin neljä eri ristisilloitusasteista hydrogeeliä: ei-pH-neutraloitu, pH-neutraloitu, yksi ristisilloitettu sukkinimidyylivaleraatti-polyetyleeniglykoli-sukkinimidyylivaleraatilla (SVA-PEG-SVA) ja yksi ristisilloitettu SVA-PEG-SVA:lla sekä tyrosinaasilla. Kahden ristisilloittajan lisääminen johti suurimpaan ristisilloitusasteeseen, joka havaittiin trinitrobentseenisulfonihappo (TNBS)-määrityksellä. Ristisilloituksen vaikutus geelien huokoisuuteen määritettiin pyyhkäisyelektronimikroskopialla (SEM). Tulosten mukaan ristisilloitusaste oli kääntäen verrannollinen huokoisuuteen. Hydrogeelien viskositeetti ja geeliytymiskinetiikka määritettiin reologisilla mittauksilla. Viskositeetin ja ristisilloitusasteen huomattiin olevan suoraan verrannollisia. Lisäksi kaikkien hydrogeelien havaittiin olevan leikkausohenevia. Geeliytymiskinetiikan tulokset osoittivat, SVA-PEG-SVA:n ja tyrosinaasin lisäämisen aiheuttavan hitaimman kokonaisvaltaisen ristisilloituksen. Reologisten mittausten tulokset olivat linjassa TNBS- ja SEM-tulosten kanssa. Lopulta tutkittiin dECM-hydrogeelin ja PVA-ristikon bioyhteensopivuutta. Maksan HepG2-syöpäsoluja sekoitettiin SVA-PEG-SVA- ja tyrosinaasi-ristisilloitettuun hydrogeeliin, joka valettiin ristikon päälle. Solujen proliferaatio määritettiin alamarBlue- ja Live/Dead-menetelmillä. AlamarBlue osoitti proliferaation eksponentiaalisen lisääntymisen päivien 1 ja 7 välillä, mitä tukivat Live/Dead-menetelmän tulokset. Tässä opinnäytetyössä kudosteknologisilla menetelmillä kehitettiin soluviljelyalusta maksan dECM-hydrogeelistä ja 3D-tulostetusta PVA-ristikosta. Ristisilloittajien vaikutus dEMC-hydrogeeliin määritettiin optimaalisen koostumuksen ja ominaisuuksien saamiseksi. Lopuksi soluviljelyalustan havaittiin tukevan HepG2-solujen proliferaatiota 7 päivän ajan.