Production and Characterization of α- and β-Carbonic Anhydrases from Pathogenic Parasite Trichomonas Vaginalis and Probiotic Bacteria Lactobacillus Rhamnosus GG
Urbański, Linda (2022)
Urbański, Linda
Tampere University
2022
Lääketieteen, biotieteiden ja biolääketieteen tekniikan tohtoriohjelma - Doctoral Programme in Medicine, Biosciences and Biomedical Engineering
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Väitöspäivä
2022-12-16
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-03-2625-8
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-03-2625-8
Tiivistelmä
Antibioottiresistentit taudinaiheuttajat ovat valtava ongelma lääketieteessä. Niiden nujertamiseksi tarvitaan lääkkeitä, jotka vaikuttavat uusilla mekanismeilla kohdemolekyyleissä. Eräs tällainen mahdollinen lääkkeiden kohde on hiilihappoanhydraasit (HAt). Niiden toiminta edellyttää metalli-ionia (yleensä sinkki- ionia) aktiivisessa kohdassa, mistä nimitys metalloentsyymit. HA:t on jaettu kahdeksaan eri entsyymiperheeseen (α, β, γ, δ, ζ, η, θ, ja ι), jotka eroavat toisistaan geneettisesti ja rakenteellisesti, vaikka niiden perustehtävä on sama. HA:t nopeuttavat kemiallista reaktiota, jossa vedestä (H2O) ja hiilidioksidista (CO2) tuotetaan protoneja (H+) ja bikarbonaatti-ioneja (HCO3-). Kyseisen reaktion ansiosta eliöt pystyvät säätelemään happoemästasapainoaan ja se on oleellinen osa myös solujen hiilidioksidin kuljetusta.
Ihmisten HA:t ovat poikkeuksetta α-muotoa. Ihmiselle haitallisia patogeenejä, joilla on vain β- ja/tai γ-muotoa on löydetty useita. Koska β- ja/tai γ-muodot eroavat ihmisen HA:ista, niitä on alettu tutkia uudenlaisina lääkekohteina.
HA-inhibiittorien avulla voidaan estää kohde-entsyymi(e)n elintärkeä toiminta. Ihannetapauksessa tämä johtaisi kohdepatogeenin eliminoimiseen in vivo vaikuttamatta ihmisen α-HA:ien toimintaan. Kullakin HA:lla, myös tietyn geeniperheen sisällä, on tietyt kineettiset, inhibitoristiset ja rakenteelliset ominaisuudet. Näiden ominaisuuksien selvittäminen mahdollistaa tarkempien ja nopeampien HA-inhibiittorien tuottamisen. Lisäksi jokainen uusi karakterisoitu HA- molekyyli lisää yleistietoa näistä evolutionaarisesti ikivanhoista entsyymeistä.
Tässä väitöskirjassa tuotettiin ja karakterisoitiin kahden mikro-organismin HA:t. Toinen tutkimuskohteista on kliinisesti merkittävää patogeeni Trichomonas vaginalis, ja toinen ihmisen normaaliin bakteeriflooraan kuuluva Lactobacillus rhamnosus GG. Väitöskirjan tarkoituksena oli identifioida, tuottaa ja karakterisoida uusia lääkekohteita trikomoniaasi-sukupuolitautia vastaan. Tuotetujen rekombinanttiproteiinien rakennetta tutkittiin röntgenkristallografialla ja valonsironnalla sekä niiden entsyymiaktiivisuutta ja inhibiittori-spesifisyyksiä ”pysäytysvirtaus fluoresenssispektrofotometrillä” (engl. applied stopped-flow instrument). Näiden lisäksi tutkittiin kliinisesti käytössä olevan lääkkeen asetatsoliamidin vaikutusta maitohappobakteerien kasvuun.
Yhdistelmä-DNA-tekniikka osoittautui toimivaksi tuottosysteemiksi T. vaginaliksen kahdelle β-HA:lle ja L. rhamnosus GG:n α-HA:lle. Sen sijaan α-HA:n puhdistus maitohappobakteereista itsestään ei tuottanut tulosta. Kinetiikkamittauksista saatiin selville, että molemmat T. vaginaliksen β-HA:t sekä L. rhamnosus GG:n α-HA omaavat kohtalaisen entsyymiaktiivisuuden. Inhibiittorikokeet puolestaan osoittivat, että kaikki kolme tutkittua HA:ta on mahdollista inhiboida useilla primaarisillä sulfonamideilla. Lisäksi rakenteellisista tutkimuksista kävi ilmi, että T. vaginaliksen β- HA:t ovat homodimeerejä ja rakenteellisesti hyvin samankaltaisia. Kummankin β- HA:n monomeerikohtainen aktiivinen kohta koostuu kahdesta kysteiinistä ja yhdestä histidiinistä. In vitro-tutkimus asetatsolamidilla osoitti minimaalisen vaikutuksen L. rhamnosus GG bakteerikasvuun. Kyseistä lääkettä voitaisiin todennäköisesti siis käyttää ilman, että se johtaisi ihmisen maitohappobakteeriflooran häviämiseen.
Tässä työssä selvisi, että T. vaginaliksen kaksi β-HA:ta mahdollista inhiboida erilaisilla sulfonamideilla. Käyttäen näitä lähtörakenteina lääkeainesuunnittelussa, voitaisiin tulevaisuudessa kehittää entistä tehokkaampia ja spesifisempiä inhibiittoreita, jotka voisivat toimia uudenlaisina lääkkeinä trikomoniaasi- sukupuolitautia vastaan. Tutkimukset L. rhamnosus GG:n α-HA:lla toivat uutta tietoa siitä, mitkä sulfonamidit, ja missä määrin, inhiboivat kyseisen HA:n toimintaa. Sen kaltaisia sulfonamideja tulisi välttää lääkeaineina, jotta ne eivät vaikuttaisi inhiboivasti normaaliflooran maitohappobakteerikantoihin.
Ihmisten HA:t ovat poikkeuksetta α-muotoa. Ihmiselle haitallisia patogeenejä, joilla on vain β- ja/tai γ-muotoa on löydetty useita. Koska β- ja/tai γ-muodot eroavat ihmisen HA:ista, niitä on alettu tutkia uudenlaisina lääkekohteina.
HA-inhibiittorien avulla voidaan estää kohde-entsyymi(e)n elintärkeä toiminta. Ihannetapauksessa tämä johtaisi kohdepatogeenin eliminoimiseen in vivo vaikuttamatta ihmisen α-HA:ien toimintaan. Kullakin HA:lla, myös tietyn geeniperheen sisällä, on tietyt kineettiset, inhibitoristiset ja rakenteelliset ominaisuudet. Näiden ominaisuuksien selvittäminen mahdollistaa tarkempien ja nopeampien HA-inhibiittorien tuottamisen. Lisäksi jokainen uusi karakterisoitu HA- molekyyli lisää yleistietoa näistä evolutionaarisesti ikivanhoista entsyymeistä.
Tässä väitöskirjassa tuotettiin ja karakterisoitiin kahden mikro-organismin HA:t. Toinen tutkimuskohteista on kliinisesti merkittävää patogeeni Trichomonas vaginalis, ja toinen ihmisen normaaliin bakteeriflooraan kuuluva Lactobacillus rhamnosus GG. Väitöskirjan tarkoituksena oli identifioida, tuottaa ja karakterisoida uusia lääkekohteita trikomoniaasi-sukupuolitautia vastaan. Tuotetujen rekombinanttiproteiinien rakennetta tutkittiin röntgenkristallografialla ja valonsironnalla sekä niiden entsyymiaktiivisuutta ja inhibiittori-spesifisyyksiä ”pysäytysvirtaus fluoresenssispektrofotometrillä” (engl. applied stopped-flow instrument). Näiden lisäksi tutkittiin kliinisesti käytössä olevan lääkkeen asetatsoliamidin vaikutusta maitohappobakteerien kasvuun.
Yhdistelmä-DNA-tekniikka osoittautui toimivaksi tuottosysteemiksi T. vaginaliksen kahdelle β-HA:lle ja L. rhamnosus GG:n α-HA:lle. Sen sijaan α-HA:n puhdistus maitohappobakteereista itsestään ei tuottanut tulosta. Kinetiikkamittauksista saatiin selville, että molemmat T. vaginaliksen β-HA:t sekä L. rhamnosus GG:n α-HA omaavat kohtalaisen entsyymiaktiivisuuden. Inhibiittorikokeet puolestaan osoittivat, että kaikki kolme tutkittua HA:ta on mahdollista inhiboida useilla primaarisillä sulfonamideilla. Lisäksi rakenteellisista tutkimuksista kävi ilmi, että T. vaginaliksen β- HA:t ovat homodimeerejä ja rakenteellisesti hyvin samankaltaisia. Kummankin β- HA:n monomeerikohtainen aktiivinen kohta koostuu kahdesta kysteiinistä ja yhdestä histidiinistä. In vitro-tutkimus asetatsolamidilla osoitti minimaalisen vaikutuksen L. rhamnosus GG bakteerikasvuun. Kyseistä lääkettä voitaisiin todennäköisesti siis käyttää ilman, että se johtaisi ihmisen maitohappobakteeriflooran häviämiseen.
Tässä työssä selvisi, että T. vaginaliksen kaksi β-HA:ta mahdollista inhiboida erilaisilla sulfonamideilla. Käyttäen näitä lähtörakenteina lääkeainesuunnittelussa, voitaisiin tulevaisuudessa kehittää entistä tehokkaampia ja spesifisempiä inhibiittoreita, jotka voisivat toimia uudenlaisina lääkkeinä trikomoniaasi- sukupuolitautia vastaan. Tutkimukset L. rhamnosus GG:n α-HA:lla toivat uutta tietoa siitä, mitkä sulfonamidit, ja missä määrin, inhiboivat kyseisen HA:n toimintaa. Sen kaltaisia sulfonamideja tulisi välttää lääkeaineina, jotta ne eivät vaikuttaisi inhiboivasti normaaliflooran maitohappobakteerikantoihin.
Kokoelmat
- Väitöskirjat [4945]