Optimizing co-culture conditions for human iPSC-neurons and CaCo-2 cells
Hyttinen, Magdalena (2022)
Hyttinen, Magdalena
2022
Master's Programme in Biomedical Technology
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2022-10-25
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202210037385
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202210037385
Tiivistelmä
Background and aims: The connection between brain and gut has been acknowledged for centuries. It is now known that gastrointestinal tract has straight link to the central nervous system (CNS) which further links it to the whole body. It is called gut-brain axis (GBA). GBA is a bidirectional pathway between the enteric nervous system and the CNS. It involves direct and indirect links between cognitive and emotional brain systems and peripheral intestinal functions. Abnormal GBA activity can lead to broad spectrum of pathologies since it affects the whole body. Even though the research on the GBA has increased, the understanding of the connection and its details is still limited. The discovery of induced pluripotent stem cells (iPSCs) has enabled the development of novel cell systems. Cell model with physical connection between gut cells and brain cells does not exist yet. The aim of this thesis was to optimize co-culture conditions of iPSC-neurons and CaCo-2 cells. These conditions included the co-culture media, cell co-culture proportions and cell culture time. Viable 3D co-culture could expand the understanding of GBA and allow studying the connection further.
Materials and methods: Two different cell lines were used in the thesis: hiPSC-line 04511.WTS which was differentiated into hiPSC neurons and CaCo-2 (cancer coli-2) cells. Four different experiments were performed. They included separate cultures of CaCo-2 and neuronal cells and co-cultures to find suitable culturing conditions including culture period, culturing media and cell proportions for both cell types. Cell surface and plating order of the cells was altered. Two of the experiments included only 2D cultures and other two had also 3D cultures. 2D cultures and co-cultures were cultured on plastic 48-wellplates. For 3D co-cultures 3D3C-chip, compartmentalized PDMS-based microfluidic device was used. 3D3C-chip consists of two parts, medium chamber and cell culturing chamber which are connected with microtunnels. Verification of the functionality and cell type specific protein expressions was conducted with immunofluorescence microscopy. For CaCo-2 the marker was ZO-1 and for neurons MAP2 and βIII-tubulin.
Results and discussion: Based on the phasecontrast microscopy imaging and indirect immunofluorescence staining results, it was shown in this thesis that CaCo-2 cells can be cultured on PLO and LN521 coated surfaces including 3D3C-chip. However, the results of this thesis indicate that the optimization of the co-culture was not successful, and no evidence was found for physical interaction between the cell types using the imaging techniques. After 14 days of the co-culture the morphology of the neuronal cells was abnormal and the number of the cells in the culture was low in both 2D and 3D co-cultures. Despite its exploratory nature, this thesis gives preliminary insight into the optimization process of the co-culture for intestinal epithelial cells and neuronal cells. Tausta ja tavoitteet: Aivojen ja suoliston välinen yhteys on tunnettu jo vuosisatojen ajan. Nykyään tiedetään, että ruoansulatusjärjestelmästä on suora yhteys keskushermostoon ja sitä kautta koko kehoon. Tätä yhteyttä kutsutaan suoli-aivo-akseliksi. Suoli-aivo-akseli on kaksisuuntainen viestintäreitti enteerisen hermoston ja keskushermoston välillä. Siihen kuuluvat suorat ja epäsuorat yhteydet kognitiivisten ja emotionaalisten aivojärjestelmien ja suoliston toimintojen välillä. Suoli-aivo-akseli osallistuu koko kehon hemostasian ylläpitämiseen, joten häiriöt sen toiminnassa voivat vaikuttaa monien eri sairauksien puhkeamiseen. Viimeaikaisesta kiinnostuksesta ja tutkimuksen lisääntymisestä huolimatta suoli-aivo-akselin kaikkia toimintamekanismeja ei vielä ymmärretä täysin. Ihmisen indisoitujen lähes kaikkikykyisten kantasolujen käyttö on mahdollistanut uusien solumallien kehittämisen, mutta solumallia, jossa suolen epiteelin solut ovat suorassa kosketuksessa hermosolujen kanssa, ei ole vielä kehitetty. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli optimoida yhteiskasvatuksen olosuhteet indusoiduista lähes kaikkikykyisistä kantasoluista (iPS-solut) erilaistetuille hermosoluille ja CaCo-2 suolisoluille. Kolmiulotteinen solumalli laajentaisi ymmärrystä suoli-aivo-akselista ja mahdollistaisi uusia tutkimussuuntia.
Metodit: Tutkimuksessa käytettiin kahta eri solulinjaa: hermosoluja, jotka erilaistettiin iPS-soluista ja CaCo-2 suolisoluja. Tutkimus jakautui neljään eri osaan, joissa hyödynnettiin sekä 2D, että 3D soluviljelmiä yhteiskasvatuksen olosuhteiden optimoimiseksi. Optimoitavana olivat kasvatuksen kesto, kasvatusmedium ja solujen määrä. Näiden lisäksi kasvatusalustaa ja kasvatuksen ajoitusta eri solutyyppien kohdalla muunneltiin tarvittaessa. 3D-soluviljelmissä käytettiin 3D3C-siruja, jotka ovat kahdesta osasta koostuvia mikrofluidistisia laitteita. Kasvatusmediumkammioita ja soluviljelykammioita erottavat mikrotunnelit. Solujen elinkyky ja solutyypeille spesifisten proteiinien eritys varmistettiin immunofluoresenssivärjäyksillä.
Tulokset: Faasikontrastimikroskopoinnin ja immunofluoresenssivärjäysten perusteella osoittautui, että CaCo-2 suolisoluja voidaan kasvattaa polyornitiini ja ihmisen laminiini 521 proteiinialustalla. Lisäksi todettiin, että CaCo-2 suolisoluja voidaan onnistuneesti kasvattaa 3D3C-siruilla. Tästä huolimatta, yhteiskasvatuksessa ei ollut havaittavissa käytetyillä kuvantamismenetelmillä hermo- ja suolisolujen välistä yhteyttä. Kahden viikon yhteiskasvatuksen jälkeen 2D- ja 3D-soluviljelmissä oli havaittavissa molempia solutyyppejä, mutta hermosolujen morfologia oli epänormaali ja niiden määrä oli vähäinen. Tutkimuksen kokeellisuudesta huolimatta se taustoittaa tulevaa tutkimusta suolen epiteelin ja hermosolujen yhteiskasvatukselle ja suoli-aivo-akselin solutason tutkimiselle.
Materials and methods: Two different cell lines were used in the thesis: hiPSC-line 04511.WTS which was differentiated into hiPSC neurons and CaCo-2 (cancer coli-2) cells. Four different experiments were performed. They included separate cultures of CaCo-2 and neuronal cells and co-cultures to find suitable culturing conditions including culture period, culturing media and cell proportions for both cell types. Cell surface and plating order of the cells was altered. Two of the experiments included only 2D cultures and other two had also 3D cultures. 2D cultures and co-cultures were cultured on plastic 48-wellplates. For 3D co-cultures 3D3C-chip, compartmentalized PDMS-based microfluidic device was used. 3D3C-chip consists of two parts, medium chamber and cell culturing chamber which are connected with microtunnels. Verification of the functionality and cell type specific protein expressions was conducted with immunofluorescence microscopy. For CaCo-2 the marker was ZO-1 and for neurons MAP2 and βIII-tubulin.
Results and discussion: Based on the phasecontrast microscopy imaging and indirect immunofluorescence staining results, it was shown in this thesis that CaCo-2 cells can be cultured on PLO and LN521 coated surfaces including 3D3C-chip. However, the results of this thesis indicate that the optimization of the co-culture was not successful, and no evidence was found for physical interaction between the cell types using the imaging techniques. After 14 days of the co-culture the morphology of the neuronal cells was abnormal and the number of the cells in the culture was low in both 2D and 3D co-cultures. Despite its exploratory nature, this thesis gives preliminary insight into the optimization process of the co-culture for intestinal epithelial cells and neuronal cells.
Metodit: Tutkimuksessa käytettiin kahta eri solulinjaa: hermosoluja, jotka erilaistettiin iPS-soluista ja CaCo-2 suolisoluja. Tutkimus jakautui neljään eri osaan, joissa hyödynnettiin sekä 2D, että 3D soluviljelmiä yhteiskasvatuksen olosuhteiden optimoimiseksi. Optimoitavana olivat kasvatuksen kesto, kasvatusmedium ja solujen määrä. Näiden lisäksi kasvatusalustaa ja kasvatuksen ajoitusta eri solutyyppien kohdalla muunneltiin tarvittaessa. 3D-soluviljelmissä käytettiin 3D3C-siruja, jotka ovat kahdesta osasta koostuvia mikrofluidistisia laitteita. Kasvatusmediumkammioita ja soluviljelykammioita erottavat mikrotunnelit. Solujen elinkyky ja solutyypeille spesifisten proteiinien eritys varmistettiin immunofluoresenssivärjäyksillä.
Tulokset: Faasikontrastimikroskopoinnin ja immunofluoresenssivärjäysten perusteella osoittautui, että CaCo-2 suolisoluja voidaan kasvattaa polyornitiini ja ihmisen laminiini 521 proteiinialustalla. Lisäksi todettiin, että CaCo-2 suolisoluja voidaan onnistuneesti kasvattaa 3D3C-siruilla. Tästä huolimatta, yhteiskasvatuksessa ei ollut havaittavissa käytetyillä kuvantamismenetelmillä hermo- ja suolisolujen välistä yhteyttä. Kahden viikon yhteiskasvatuksen jälkeen 2D- ja 3D-soluviljelmissä oli havaittavissa molempia solutyyppejä, mutta hermosolujen morfologia oli epänormaali ja niiden määrä oli vähäinen. Tutkimuksen kokeellisuudesta huolimatta se taustoittaa tulevaa tutkimusta suolen epiteelin ja hermosolujen yhteiskasvatukselle ja suoli-aivo-akselin solutason tutkimiselle.