Immuno-engineering of Cells and Biomaterials for Biomedical Applications

Abstract

Immuunijärjestelmän muodostavat immuunisolut, jotka pitävät kehomme turvassa ja auttavat torjumaan eri taudinaiheuttajien välittämiä infektioita sekä ovat keskeisessä roolissa homeostaasin säätelyssä, haavan paranemisessa ja kudosten uusiutumisessa. Onnistuneen hoidon saavuttamiseksi on potilaan kehoon lisätyn implantin tai muiden vieraiden aineiden, kuten biomateriaalien, nanopartikkeleiden, pienimolekyylisten lääkkeiden tai elävien solujen selviydyttävä monimutkaisessa immuuniympäristössä. Tämän vuoksi on ensiarvoisen tärkeää kehittää uusia teknisiä ratkaisuja tai immuunivasteisia biomateriaaleja, jotka pystyvät turvallisesti muuttamaan aggressiivista immuunijärjestelmää tai hyödyntämään immuunijärjestelmän "soluja tappavia" tai "haavoja parantavia" ominaisuuksia potilaiden sairauksien hoidossa. Tähän ongelmaan liittyen tässä väitöskirjassa kehitettiin uusia biotekniikan strategioita, jotka hyödyntävät nanolääketieteen tai kudosteknologian lähestymistapoja immuunijärjestelmän muuttamiseksi.

Tässä väitöskirjassa on käytetty nanokantajien ja hydrogeelitukirakenteiden suunnittelussa hyaluronihappoa (eng. hyaluronic acid, HA). HA-pohjaiset nanopartikkelit suunniteltiin syövän vastaisiin sovelluksiin, kun taas immunosuppressiiviset HA-pohjaiset hydrogeelitukirankenteet suunniteltiin kudosteknologian sovelluksiin. HA-nanopartikkelit suunniteltiin käyttäen uutta itsekokoontumisstrategiaa, jossa vettä hylkivä immunosuppressiivinen lääke, deksametasoni, yhdistettiin HA-runkoon amfifiilisyyden luomiseksi. Tämän jälkeen tunnettu kemoterapialääke, doksorubisiini, lastattiin nanopartikkeliin. Nämä lääkettä sisältävät HA-nanopartikkelit muodostivat ihanteellisen nanokantajan yhdistelmähoitoon ja lääkkeenkuljetusjärjestelmää tutkittiin sen syövänvastaisen aktiivisuuden, makrofagien polarisaatiopotentiaalin ja sen kyvyn muuttaa trombiintulehdusta ihmisen kokoveressä. Havaittiin, että uusi HA-pohjainen nanokantaja esti verihiutaleiden yhteen kasautumista ja trombiinin muodostumista, mitä doksorubisiini yleensä aiheuttaa. HA-pohjainen nanokantaja aiheutti myös kasvaimeen liittyvien makrofagien repolarisaation M1-makrofageiksi, mikä on osoituksena tulehdusta edistävien geenien, kuten TNF:n, ilmentymisen lisääntymisestä.

Toinen väistökirjan keskeinen tavoite on terapeuttisten solujen, kuten mesenkymaalisten kantasolujen (eng. mesenchymal stem cells, MSC) toimittaminen kohteeseen. MSC-solujen aiheuttama tromboottinen aktiivisuus allotransplantaation jälkeen on suuri haaste solupohjaisissa hoidoissa, koska nämä solut laukaisevat veren hyytymisen ja komplementtijärjestelmän aktivoitumisen suonensisäisen infuusion jälkeen. Tämä johtaa solujen huonoon <i>in vivo </i>eloonjäämiseen. Haasteen välttämiseksi hyödynsimme kahta riippumatonta strategiaa. Suunnittelimme uudet pluronic- pohjaiset nanomisellit, jotka oli yhdistetty pelkistävää disulfidilinkkeria sisältävään siRNA:han. Tämä yhdistelmä osoittautui tehokkaaksi geenin vaimentamisessa (~ 70 %) MSC-soluissa. Kudostekijägeenin tehokas vaimentaminen MSC-soluissa paransi merkittävästi veriyhteensopivuutta ihmisen kokoveressä, koska ne eivät aktivoineet komplementti- ja hyytymisreittejä. Yllättäen kudostekijän vaimentaminen johti parakriinisen signaalin ja erilaistumispotentiaalin parantumiseen ennestään tuntemattoman molekyylireitin kautta. Toisessa strategiassa pinnoitimme MSC-solut käyttäen kahta polyelektrolyytiä layer-by-layer (LbL)-tekniikalla: hepariinia ja gelatiinia (H/G). Näiden päällystettyjen solujen havaittiin parantavan veriyhteensopivuutta, kun niitä tutkittiin ihmisen kokoveressä. Myös näiden päällystettyjen solujen lisääntyminen, parakriininen signalointi ja erilaistuminen tutkittiin. Tutkimuksista paljastui, että H/G-pinnoite ei estänyt solujen parakriinisia signalointi- ja erilaistumiskykyjä.

Lopuksi kehitimme immuunivasteisen HA-hydrogeelin konjugoimalla gallushappoa. Gallolin lisääminen HA-hydrogeeliin paransi adhesiivisia sekä antioksidanttisia ominaisuuksia, samalla kun se tarjosi hydrogeelille pseudoplastiset/itseparantuvat ominaisuudet. Yllättäen gallushapon funktionalisointi tarjosi immunosuppressiivisia ominaisuuksia, mikä varmistettiin viljelemällä primäärisiä hiiren M1-makrofageja. Gallolifunktionalisoitujen HA- geelien ihonalainen implantointi terveisiin hiiriin osoitti immunosuppressiivisten myeloidisolujen tunkeutumista näissä hydrogeeleissä. Kun taas kontrolli-HA- geeleissä havaittiin suurempi määrä tulehdusta edistäviä myeloidisoluja.

Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä väitöskirja esittelee laajan valikoiman teknisiä strategioita immuunijärjestelmän säätelyyn. Strategiat tukivat kantasolujen parempaa eloonjäämistä transplantaation jälkeen, tarjosivat kemoterapeuttisten aineiden turvallisemman kuljettamisen käyttämällä biomimeettisiä HA-pohjaisia nanokantajia ja tunnistivat gallushapon immunomodulatoriseksi molekyyliksi, jota voidaan hyödyntään immunosuppressiivisten 3D tukirakenteiden suunnittelussa kudosteknologian sovelluksiin.

Immune cells that constitute our immune system keep the human body safe and help in warding off infections mediated by different pathogens and also play a key role in regulating homeostasis, wound healing, and regeneration of tissues. Implantation or infusion of foreign agents such as biomaterials, nanoparticles, small molecule drugs, or living cells needs to navigate the complex immune landscape for successful therapeutic outcomes. Thus, devising new engineering tools or immune-responsive biomaterials that can safely traverse/modulate the aggressive immune system or harness the ‘cell-killing’ or ‘wound healing’ properties of the immune system as a potent tool for treating human diseases are of paramount importance for developing new therapies. In this context, this dissertation has developed new bioengineering strategies adopting nanomedicine or tissue engineering approaches for modulating our immune system which was successfully demonstrated for anti-cancer studies, stem cell delivery, and tissue regeneration applications.

Here in this thesis, hyaluronic acid (HA), one of the key polymers of our extracellular matrix (ECM) has been used as a major building block for engineering nanocarriers and a hydrogel scaffold. The HA-derived nanoparticles were designed for anti-cancer applications and immunosuppressive HA-based hydrogel scaffolds were designed for tissue engineering applications. The HA nanoparticles were designed following a novel self-assembly strategy where hydrophobic immunosuppressive drug, dexamethasone was conjugated to the HA backbone to induce amphiphilicity, which was subsequently loaded with a well-known chemotherapy drug, doxorubicin. These drug-loaded HA-nanoparticles formed an ideal nanocarrier for combination therapy and the delivery system was tested for its anticancer activity, macrophage polarization potential, and its capability to modulate thromboinflammation in human whole blood. Gratifyingly, the novel HA-based nanocarrier was found to suppress platelet aggregation and thrombin generation that are trigged by doxorubicin. The HA-based nanocarrier also triggered the repolarization of tumor-associated macrophages to M1 macrophages as evidenced by the increase in expression of proinflammatory genes like TNF.

Delivering therapeutic cells such as mesenchymal stem cells (MSCs) is another key objective of this thesis. The thrombotic activity induced by MSCs after allotransplantation is a major obstacle in the field of cell-based therapies as these cells trigger the activation of coagulation and complement cascade, after intravenous infusion leading to poor in-vivo survival. To circumvent this challenge, we adopted two independent approaches, namely nanoparticle-mediated tissue factor gene silencing and layer-by-layer polyelectrolyte coating. We designed a novel pluronic- based nanomicelles conjugated with siRNA bearing a reducible disulfide linker that displayed efficient gene silencing (~70%) in MSCs. The effective silencing of the tissue factor gene in MSCs significantly enhanced the hemocompatibility in human whole blood as they did not activate the complement and coagulation pathways. Surprisingly, the silencing of tissue factor resulted in enhanced paracrine signaling and differentiation potential through some unknown molecular pathway. In the second strategy, we coated the MSCs with two polyelectrolytes namely, heparin and gelatin (H/G) in a layer by layer (LbL) manner. These coated cells were found to enhance hemocompatible when studied in human whole blood. The proliferation, paracrine signaling aspects and differentiation aspects of these coated cells were also studied. These studies revealed that the H/G coating did not hinder the paracrine signaling and differentiation capabilities of the cells.

Finally, we engineered an immunoresponsive HA hydrogel by conjugating gallic acid, a polyphenol that is known to display antioxidant properties and are found in green tea, and other medicinal plants. The addition of gallol to HA hydrogel enhanced the adhesive and antioxidant properties while also providing a shear thinning/self-healing property to the hydrogel. Surprisingly, gallic acid functionalization provided immunosuppressive characteristics as verified by culturing primary murine M1 macrophages. Subcutaneous implantation of gallol- functionalized HA gels in healthy mice displayed infiltration of immunosuppressive myeloid cells within these gels, while higher numbers of pro-inflammatory myeloid cells were observed in the control HA gels.

In conclusion, this dissertation formulates a wide range of engineering strategies for regulating our immune system that supported enhanced survival of stem cells after transplantation, provided safer delivery of chemotherapeutic agents using biomimetic HA-based nanocarriers, and identified gallic acid as an immunomodulatory molecule that can be exploited to design immunosuppressive 3D scaffolds for tissue engineering applications.