Circulating microRNAs as Biomarkers for Multiple Sclerosis

Abstract

<b>Tausta</b>: Multippeliskleroosi (MS) on immuunivälitteinen keskushermoston demyelinisoiva ja rappeuttava tulehduksellinen sairaus, joka aiheuttaa vakavia neurologisia toimintahäiriöitä ja johtaa potilaiden vammautumiseen. Huolimatta MS- tautiin ehdotettujen molekyylibiomarkkereiden suuresta määrästä vain muutamia niistä on tiukasti validoitu ja käytetty kliinisesti. MikroRNA:t (miRNA:t) ovat pieniä ei-koodaavia RNA:ita ja niiden on osoitettu toimivan avainmolekyyleinä useiden sairauksien patogeneesissä ja kehityksessä. MiRNA:t säätelevät geenin ilmentymistä transkription jälkeisellä tasolla joko estämällä mRNA: translaatiota tai edesauttamalla kohde-mRNA:sa hajoamista. MiRNA-järjestelmä on uusi genominen säätelykerros, joka yhdistää kymmeniä tai satoja kohdegeenejä tai niiden muodostamia aineenvaihduntareittejä yhden miRNA:n säätely alaisuuteen. Huomioiden miRNA:iden hyvä stabiilius ja niiden suhteellisen helppo analysointi, verenkierron miRNA:t ovat lupaavia uusia biomarkkeriehdokkaita MS-tautiin ja sen kliinisten alatyyppien diagnostiikkaan ja voivat tarjota merkittävää lisäarvoa myös taudin kulun ennustamisessa ja sen terapeuttisten vasteiden optimoinnissa.

<b>Tavoitteet</b>: Tämä väitöskirjatyö keskittyi tutkimaan ihmisen verenkierrossa olevien miRNA:iden osuutta MS-taudin ja sen kliinisten alatyyppien biomarkkereina sekä yhteyttä taudin kliinisen aktiivisuuden ja vaikeusasteen kanssa.

<b>Aineistot ja menetelmät</b>: Verenkierrossa olevien miRNA:iden (n=84) ilmentymistä tutkittiin yhteensä 290 henkilön seerumista: 81 aaltomaista MS-tautia (RRMS), 66 ensisijaisesti etenevää MS-tautia (PPMS), 45 toissijaisesti etenevää MS-tautia (SPMS) ja 18 kliinisesti eriytynyttä oireyhtymää (CIS) sairastavilla sekä 80 terveellä kontrollihenkilöllä (osatyöt I-III). MiR-128-3p:n, miR-191-5p:n, miR-24-3p:n ja miR-223-3p:n ilmentymistä tutkittiin myös neljän vuoden seurannan aikana 57 MS- potilaalla, 18 CIS-potilaalla ja 32 ikä ja sukupuoli kaltaistetussa kontrollilla (osatyö III). MiScript seerumin miRNA RT-PCR-määritystekniikoita käytettiin valittujen miRNA:iden suhteellisten ilmentymistasojen mittaamiseen. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä SPSS-versiota 22.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) tutkimuksissa I-III.

<b>Tulokset</b>: Tutkituista miRNA:ista (n=84) miR-128-3p ilmensi eniten potentiaalia etenevän MS-taudin diagnostisena biomarkkerina, koska se oli yli-ilmentynyt PPMS:ssä verrattuna SPMS:ään (osatyö I) ja terveisiin kontrolleihin (osatyöt I-III). MiR-191-5p yli-ilmentyi RRMS:ssä (osatyöt II-III), PPMS:ssä (osatyöt I-II) ja SPMS:ssä (osatyö I) verrattuna terveisiin kontrolleihin. Kun taas miR-24-3p yli- ilmentyi PPMS:ssä verrattuna SPMS:ään (osatyö I) ja terveisiin kontrolleihin (I-II) sekä RRMS:n verrattuna terveisiin kontrolleihin (II). Mitä tulee miR-376c-3p:hen sen yli-ilmentymistä havaittiin PPMS:ssä verrattuna terveisiin kontrollihenkilöihin (osatyö I). Tutkimukseen III sisältyvä miR-223-3p ei osoittanut tilastollisesti merkitseviä eroja minkään MS-alatyypin ja terveiden kontrollihenkilöiden tai CIS:n välillä. MiR-128-3p:n ja miR-24-3p:n ilmentyminen oli vakaa neljän vuoden seurantajakson ajan, kun taas miR-191-5p:n ja miR-223-3p:n ajallisia muutoksia havaittiin MS:ssa mutta ei CIS:ssä. Kun taudin kliininen aktiivisuus otettiin huomioon miR-191-5p:ssä havaittiin ajallisia muutoksia potilailla, joilla oli lisääntyvä disabiliteetti EDSS-pisteillä luokiteltuna tai aivojen magneettikuvauksessa havaitut lisääntyvät T1- tai FLAIR-leesiovolyymit kun taas miR-223-3p vaihteli relapsiaktiivisessa RRMS:ssä.

<b>Johtopäätökset</b>: Yhdistettynä tämän väitöskirjatyön tulokset heijastelevat verenkierron miRNA:iden, erityisesti miR-191-5p:n ja miR-24-3p:n merkitystä MS- taudin diagnostisina biomarkkereina ja miR-128-3p:n tärkeyttä PPMS:n diagnostisena biomarkkerina. Lisäksi miR-191-5p ja miR-223-3p voivat mahdollisesti heijastaa MS-taudin patologiaan liittyviviä ajallisia muutoksia.

<b>Background</b>: Multiple sclerosis (MS) is an immune-mediated demyelinating and degenerative inflammatory disease of the central nervous system that causes severe neurological dysfunction and leads to disabilities in patients. Despite a large number of molecular biomarkers proposed for MS, only a few of them have been rigorously validated and used clinically. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs, shown to associate with pathogenesis and development of various diseases, including MS. miRNAs regulate gene expression at the post-transcriptional level through translational inhibition or degradation of target mRNA. Single miRNA can regulate expression of multiple target genes, and one mRNA can be targeted by multiple miRNAs, creating a complex regulatory network. Considering their stability and relative ease of detection, circulating miRNAs are promising new biomarker candidates for MS and its clinical subtypes that may provide significant additive value for disease diagnostics, prediction of disease course, and monitoring therapeutic responses.

<b>Aims</b>: This doctoral thesis focused on exploring the role of human circulating miRNAs as biomarkers of MS disease and its clinical subtypes and association with the clinical activity and severity of the disease.

<b>Subjects and Methods</b>: The expressions of circulating miRNAs were studied in serum of a total of 290 subjects: 81 relapsing-remitting (RRMS), 66 primary progressive (PPMS), 45 secondary progressive (SPMS), 18 clinically isolated syndrome (CIS), and 80 healthy controls (HC) (Studies I-III). The expression of miR-128-3p, miR-191-5p, miR-24-3p, and miR-223-3p was evaluated over the four- year follow-up in 57 MS cases, 18 CIS patients, and 32 age- and sex-matched HCs (Study III). MiScript serum miRNA RT-PCR assay techniques were used to measure relative expression levels of selected miRNAs. Statistical analyses were performed using SPSS version 22.0 (IBM corporation, Armonk, NY, USA) in Studies I-III.

<b>Results</b>: From 84 miRNAs studied, miR-128-3p expressed the most potential as a diagnostic biomarker for progressive MS, as it was overexpressed in PPMS, as compared to SPMS (Study I) and HCs (Study I, III). In turn, miR-191-5p was overexpressed in all the MS subtypes in comparison to HCs, but not to CIS or each other (Study I-III). In addition, miR-24-3p was overexpressed in PPMS to SPMS (Study I), PPMS to HCs (Study I-II), and RRMS to HCs (Study II) comparisons. As for miR-376c-3p, its overexpression was observed in PPMS to HCs comparison (Study I). While miR-223-3p, included in study III, showed no statistically significant differences between MS subtypes and HCs or CIS. The expression of miR-128-3p and miR-24-3p was stable over the four-year follow-up period, while temporal changes of miR-191-5p and miR-223-3p were observed in MS but not in CIS. When the clinical activity was taken into the consideration, temporal changes in miR-191- 5p were observed among the patients with an increase in expanded disability status scale (EDSS) or magnetic resonance imaging T1 or FLAIR lesion volumes, while miR-223-3p fluctuated in relapse active RRMS.

<b>Conclusions</b>: The results of this doctoral thesis suggested the potential of circulating miRNAs, especially miR-191-5p and miR-24-3p, as diagnostic biomarkers for MS and miR-128-3p for PPMS. In addition, miR-191-5p and miR-223-3p can potentially reflect temporal changes related to MS pathology.