JAK-STAT Signaling and Inhibition in Immunological Diseases

Abstract

Janus kinaasi (JAK) – signaalinvälittäjä ja transkriptioaktivaattori (STAT) reitti on yksi keskeisimmistä signaalinvälitysreiteistä kehoissamme. JAK-STAT reitti säätelee lukuisia biologisia toimintoja, kuten immuunivastetta, aineenvaihduntaa, hematopoieesia sekä kehitystä. Mutaatiot JAKeissa, STATeissa tai niiden toimintaa säätelevissä proteiineissa voivat aiheuttaa virheellisen JAK-STAT signalointivasteen, joka voi johtaa vakaviin sairauksiin. Myös tulehduksellisissa sairauksissa tyypillisesti esiintyvä sytokiiniympäristö voi aiheuttaa JAK-STAT reitin yliaktivaation. Janus kinaasit nähtiinkin potentiaalisina lääkekehityskohteina jo pian niiden tunnistamisen jälkeen. Tällä hetkellä kliinisessä käytössä on jo useita hyväksyttyjä JAK-estäjiä tulehduksellisten sairauksien ja hematologisten syöpien hoitoon.

Tässä väitöskirjassa tutkittiin JAK-STAT reittien aktivaatiota harvinaisessa ja aiemmin määrittelemättömässä, immunologisessa sairaudessa virtaussytometria- menetelmää hyödyntäen. Toisessa osatyössä tutkittiin JAK-estäjä tofasitinibin <i>in vivo</i> vaikutusta eri JAK-STAT reitteihin lääkettä käyttävillä nivelreumapotilailla samankaltaisella metodologialla. Lisäksi analysoimme ja vertailimme keskenään 20 kliinisissä tutkimuksissa arvioidun JAK-estäjän selektiivisyyttä <i>in vitro</i> käyttäen sekä entsyymiaktiivisuutta että sytokiini-inhibitiota mittaavia menetelmiä.

Työssä kuvaillaan uusi mutaatio IRF2BP2 geenissä, joka löydettiin kahdelta potilaalta, joilla oli sekä tulehduksellisia oireita että lymfopeniaa. Osoitimme, että IRF2BP2 proteiini on tärkeä erityisesti JAK-STAT välitteisen interferonivasteen säätelyssä. JAK-estäjillä tehdyissä tutkimuksissa osoitettiin, että tofasitinibi estää useiden JAK-STAT reittien aktivaation, mutta estämisen voimakkuus riippuu sekä tutkittavasta sytokiinireitistä että solupopulaatiosta. Toisaalta tofasitinibin sytokiinien estoprofiili myös jossain määrin riippuu tutkimusmenetelmästä, sillä eroavaisuuksia löydettiin <i>in vivo</i> ja <i>in vitro</i> mittausten välillä. JAK-estäjien vertailututkimus osoitti, että kliinisten JAK-estäjien selektiivisyydessä on eroja. Selektiivisyyden määrittäminen vaatii kuitenkin useiden mittausmenetelmien käyttämistä yhdistettynä farmakokineettisiin muuttujiin.

Edellä kuvatut tulokset lisäävät ymmärrystä JAK-STAT reitin ja sen estämisen merkityksestä immunologisissa sairauksissa. Immunologisia sairauksia ja JAK-estäjiä karakterisoimalla voidaan tulevaisuudessa saavuttaa entistä kohdennetumpia ja siten tehokkaampia ja turvallisempia hoitoja erilaisista immuunijärjestelmän sairauksista kärsiville potilaille.

Janus kinase (JAK) - signal transducer and activator of transcription (STAT) pathway is one of the key signaling pathways in our bodies. JAK-STAT pathway regulates numerous biological functions including the immune response, metabolism, hematopoiesis, and development. Mutations in JAKs, STATs, or their regulatory proteins can cause defective JAK-STAT signaling responses resulting in human diseases. In addition, the cytokine environment typically present in inflammatory diseases can cause overactivation of the JAK-STAT pathway. Consequently, Janus kinases were identified as potential drug targets shortly after their discovery. To date, several JAK inhibitors are in clinical use for the treatment of both inflammatory diseases and hematological malignancies.

In this thesis project, a rare, previously uncharacterized, immunological disease was investigated focusing on the activation of JAK-STAT pathways, which was studied using flow cytometry. In the second study, we analyzed the <i>in vivo</i> effects of a JAK inhibitor, tofacitinib, on different JAK-STAT pathways in patients with rheumatoid arthritis using similar methodology. In addition, the selectivity of 20 clinical JAK inhibitors was analyzed and compared by using<i> in vitro</i> methods that measure enzymatic activity and cytokine inhibition.

The results presented in this thesis describe a new mutation in the IRF2BP2 gene found in two patients having both inflammatory symptoms and lymphopenia. We showed that IRF2BP2 protein is particularly important in the regulation of the JAK- STAT-mediated interferon response. Studies done with JAK inhibitors showed that tofacitinib inhibits the activation of several JAK-STAT pathways, but the extent of inhibition depends on both the cytokine pathway and the cell population studied. On the other hand, the cytokine inhibition profile of tofacitinib also depends to some extent on the methodology, as differences were found between the <i>in vivo </i>and <i>in vitro</i> measurements. Comparison of 20 JAK inhibitors revealed inhibitors to possess distinct selectivity profiles and demonstrated that selectivity determination requires use of multiple measurement methods combined with pharmacokinetic variables.

The results described above add to our understanding of the role of JAK-STAT pathway and its inhibition in immunological diseases. By characterizing immunological diseases and JAK inhibitors, more targeted and thus more effective and safer treatments can be achieved in the future for patients with various diseases of the immune system.