Intranuclear organization of Lamin A/C-associated chromatin in epithelial cells
Erämies, Sanni (2022)
2022
Bioteknologian ja biolääketieteen tekniikan maisteriohjelma - Master's Programme in Biotechnology and Biomedical Engineering
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2022-05-27
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202205044368
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202205044368
Tiivistelmä
Background and aims:
Chromatin interacts with the nuclear lamina (NL) via lamina associated domains (LADs). Nuclear lamin A/C is one of the main candidates for establishing this interaction, but the accurate molecular mechanisms behind it remain unclear. Importantly, Lamin A/C is known to have mechanosensitive properties; transduction of mechanical force to the nucleus is crucial for embryonic development and involved with cancer metastasis. Studying whether the force-induced effects in chromatin are conveyed via lamin A/C may thus explain features of genome organization and provide important clues for understanding the mechanisms of cancer progression. Dam-identification (DamID) is a widely used method for detection of lamin associated LADs, however, its use in epithelial cells has remained unestablished.
The aims of this thesis were (1) to describe the intranuclear distribution of lamin A/C and chromatin in epithelial cells, (2) to construct an epithelial cell line with m6a-tracer-DamID system enabling detection and characterization of lamin A/C-interacting LADs, and finally, (3) to observe the role of actin mediated mechanical tension in lamin A/C -mediated LAD organization.
Methods:
Madin Darby canine kidney type II (MDCK II) cells were used as an epithelial cell model. DamID system was constructed by co-transfecting the system components to the cells. To visualize intranuclear structures in this cell line, immunolabeling and fixed cell imaging with laser scanning confocal microscopy was used. Actin cytoskeleton was disrupted with cytochalasin D treatment to assess the effects of actin mediated force transduction to epithelial cell LADs. Obtained data tested using statistical methods to assess the amplitude and plausibility of the data.
Results:
Construction of the m6a-tracer-DamID cell line was successful. Analysis revealed LADs in the vicinity of endogenous lamin A/C. These LADs were devoid of transcriptional activity marker H3K27ac, suggesting for their transcriptional repression. Enforcing, some LADs in the apical side of the nucleus were involved with heterochromatin associated H3K9me3. Degradation of actin cytoskeleton resulted in alteration of lamin A/C organization, but these changes were not directly followed by changes in the lateral spatial distribution of LADs. However, LADs were detected to partially detach from the nuclear lamina upon actin disruption.
Conclusions:
Establishment of MDCKII-m6a-tracer-DamID cell line and its successive use in the experiments of this study indicate the compatibility of DamID system in epithelial cells. The findings of this study implicate that the lamin A/C -associated LADs contain transcriptionally repressed chromatin. Moreover, the results show that loss of actin -mediated mechanical tension in the nucleus does not affect the lateral distribution of lamin A/C -associated LADs but might be involved in tethering chromatin to the nuclear envelope. Finally, the analyses suggest that actin- mediated tension is required for the regulation of lamin A/C structural organization in epithelial cells. Tausta ja tavoitteet:
Tumalaminan tiedetään olevan vuorovaikutuksessa kromatiinin kanssa, mutta mekanismit jotka ylläpitävät ja säätelevät tätä yhteyttä ovat toistaiseksi tuntemattomat. Tuman sisäpinnalla sijaitseva lamiini A/C on yksi tärkeistä linkeistä solun tukirangan ja kromatiinin välillä. Lamiini A/C:n tiedetään reagoivan solun aistimiin mekaanisiin voimiin, joten on mahdollista, että lamiini A/C olisi vastuussa myös näiden voimien välittämisestä kromatiinille.
Tutkimalla lamiini A/C:n kanssa vuorovaikuttavaa kromatiinia pystytään paremmin ymmärtämään tärkeitä mekanismeja solun kehityksessä sekä syöpien leviämisessä. DamID- metodilla on mahdollista tunnistaa tumalaminan kanssa vuorovaikuttavia kromatiinialueita. Tätä tekniikkaa ei kuitenkaan ole aikaisemmin käytetty epiteelisoluissa. Tämän tutkielman tavoitteena oli (1) tutkia lamiini A/C:n ja kromatiinin jakaumaa epiteelisoluissa, (2) rakentaa DamID-systeemin sisältävä epiteelisolulinja ja käyttää sitä lamiini A/C:n kanssa vuorovaikuttavan kromatiinin analysointiin, ja lopuksi (3) tutkia solun tukirangan välittämän mekaanisen voiman vaikutuksia lamiini A/C:hen ja sen kanssa yhteydessä olevaan kromatiiniin.
Metodit:
Tutkimuksissa käytetty epiteelisolulinja oli Madin Darby canine kidney type II (MDCK II). DamID- systeemi muodostuu kahdesta komponentista, jotka transfektoitiin soluihin. Solun rakenteiden visualisoimiseksi käytettiin solujen immunoleimausta ja konfokaalimikroskopiaa. Aktiinivälitteisen voiman vaikutuksia tarkasteltiin hajottamalla solun tukiranka sytokalasiini D-myrkyllä. Mittausten tulokset analysoitiin käyttäen statistisia menetelmiä.
Tulokset:
Solulinjan rakentaminen onnistui, ja sillä tehdyt analyysit tunnistivat kromatiinialueita, jotka sijaitsivat hyvin lähellä lamiini A/C:tä. Näiden alueiden huomattiin sisältävän hyvin vähän aktiivista histoniasetylaatio H3K27ac:ta, viitaten vähäiseen transkriptionaaliseen aktiivisuuteen. Kromatiinin hiljennettyyn tilaan viittasi myös tuman yläpinnan osittainen vuorovaikutus heterokromatiinin kanssa tavatun tri-metyloidun H3K9:n kanssa. Lamiini AC:n C-terminaalisen epitoopin huomattiin korreloivan tumalaminan läheisyydessä tavattujen kromatiinialueiden jakauman kanssa. Aktiini-tukirangan hajoaminen sai aikaan muutoksia lamiini A/C:n organisaatiossa, mutta nämä muutokset eivät suoraan vaikuttaneet kromatiiniin jakaumaan tumassa. Kromatiinin huomattiin kuitenkin sijoittuvan kauemmas tuman pinnasta aktiinin depolymerisaation seurauksena.
Päätelmät:
Onnistunut solulinjan pystytys ja sen avulla tehdyt kokeet viittasivat siihen, että DamID-systeemi on käyttökelpoinen epiteelisoluissa. Saadun tulokset osoittivat, että lamiini A/C:n kanssa vuorovaikuttava kromatiini on transkriptionaalisesti hiljennettyä. Myrkkykokeiden mukaan aktiinivälitteinen mekaaninen voima ei suoraan heijastu kromatiiniin lamiini A/C:n kautta, mutta saattaa olla vastuussa kromatiinin kiinnittymisestä tumakalvolle. Tutkimuksissa selvisi myös, että mekaanisella voimalla on vaikutus Lamiini A/C:n rakenteelliseen organisaatioon epiteelisoluissa.
Chromatin interacts with the nuclear lamina (NL) via lamina associated domains (LADs). Nuclear lamin A/C is one of the main candidates for establishing this interaction, but the accurate molecular mechanisms behind it remain unclear. Importantly, Lamin A/C is known to have mechanosensitive properties; transduction of mechanical force to the nucleus is crucial for embryonic development and involved with cancer metastasis. Studying whether the force-induced effects in chromatin are conveyed via lamin A/C may thus explain features of genome organization and provide important clues for understanding the mechanisms of cancer progression. Dam-identification (DamID) is a widely used method for detection of lamin associated LADs, however, its use in epithelial cells has remained unestablished.
The aims of this thesis were (1) to describe the intranuclear distribution of lamin A/C and chromatin in epithelial cells, (2) to construct an epithelial cell line with m6a-tracer-DamID system enabling detection and characterization of lamin A/C-interacting LADs, and finally, (3) to observe the role of actin mediated mechanical tension in lamin A/C -mediated LAD organization.
Methods:
Madin Darby canine kidney type II (MDCK II) cells were used as an epithelial cell model. DamID system was constructed by co-transfecting the system components to the cells. To visualize intranuclear structures in this cell line, immunolabeling and fixed cell imaging with laser scanning confocal microscopy was used. Actin cytoskeleton was disrupted with cytochalasin D treatment to assess the effects of actin mediated force transduction to epithelial cell LADs. Obtained data tested using statistical methods to assess the amplitude and plausibility of the data.
Results:
Construction of the m6a-tracer-DamID cell line was successful. Analysis revealed LADs in the vicinity of endogenous lamin A/C. These LADs were devoid of transcriptional activity marker H3K27ac, suggesting for their transcriptional repression. Enforcing, some LADs in the apical side of the nucleus were involved with heterochromatin associated H3K9me3. Degradation of actin cytoskeleton resulted in alteration of lamin A/C organization, but these changes were not directly followed by changes in the lateral spatial distribution of LADs. However, LADs were detected to partially detach from the nuclear lamina upon actin disruption.
Conclusions:
Establishment of MDCKII-m6a-tracer-DamID cell line and its successive use in the experiments of this study indicate the compatibility of DamID system in epithelial cells. The findings of this study implicate that the lamin A/C -associated LADs contain transcriptionally repressed chromatin. Moreover, the results show that loss of actin -mediated mechanical tension in the nucleus does not affect the lateral distribution of lamin A/C -associated LADs but might be involved in tethering chromatin to the nuclear envelope. Finally, the analyses suggest that actin- mediated tension is required for the regulation of lamin A/C structural organization in epithelial cells.
Tumalaminan tiedetään olevan vuorovaikutuksessa kromatiinin kanssa, mutta mekanismit jotka ylläpitävät ja säätelevät tätä yhteyttä ovat toistaiseksi tuntemattomat. Tuman sisäpinnalla sijaitseva lamiini A/C on yksi tärkeistä linkeistä solun tukirangan ja kromatiinin välillä. Lamiini A/C:n tiedetään reagoivan solun aistimiin mekaanisiin voimiin, joten on mahdollista, että lamiini A/C olisi vastuussa myös näiden voimien välittämisestä kromatiinille.
Tutkimalla lamiini A/C:n kanssa vuorovaikuttavaa kromatiinia pystytään paremmin ymmärtämään tärkeitä mekanismeja solun kehityksessä sekä syöpien leviämisessä. DamID- metodilla on mahdollista tunnistaa tumalaminan kanssa vuorovaikuttavia kromatiinialueita. Tätä tekniikkaa ei kuitenkaan ole aikaisemmin käytetty epiteelisoluissa. Tämän tutkielman tavoitteena oli (1) tutkia lamiini A/C:n ja kromatiinin jakaumaa epiteelisoluissa, (2) rakentaa DamID-systeemin sisältävä epiteelisolulinja ja käyttää sitä lamiini A/C:n kanssa vuorovaikuttavan kromatiinin analysointiin, ja lopuksi (3) tutkia solun tukirangan välittämän mekaanisen voiman vaikutuksia lamiini A/C:hen ja sen kanssa yhteydessä olevaan kromatiiniin.
Metodit:
Tutkimuksissa käytetty epiteelisolulinja oli Madin Darby canine kidney type II (MDCK II). DamID- systeemi muodostuu kahdesta komponentista, jotka transfektoitiin soluihin. Solun rakenteiden visualisoimiseksi käytettiin solujen immunoleimausta ja konfokaalimikroskopiaa. Aktiinivälitteisen voiman vaikutuksia tarkasteltiin hajottamalla solun tukiranka sytokalasiini D-myrkyllä. Mittausten tulokset analysoitiin käyttäen statistisia menetelmiä.
Tulokset:
Solulinjan rakentaminen onnistui, ja sillä tehdyt analyysit tunnistivat kromatiinialueita, jotka sijaitsivat hyvin lähellä lamiini A/C:tä. Näiden alueiden huomattiin sisältävän hyvin vähän aktiivista histoniasetylaatio H3K27ac:ta, viitaten vähäiseen transkriptionaaliseen aktiivisuuteen. Kromatiinin hiljennettyyn tilaan viittasi myös tuman yläpinnan osittainen vuorovaikutus heterokromatiinin kanssa tavatun tri-metyloidun H3K9:n kanssa. Lamiini AC:n C-terminaalisen epitoopin huomattiin korreloivan tumalaminan läheisyydessä tavattujen kromatiinialueiden jakauman kanssa. Aktiini-tukirangan hajoaminen sai aikaan muutoksia lamiini A/C:n organisaatiossa, mutta nämä muutokset eivät suoraan vaikuttaneet kromatiiniin jakaumaan tumassa. Kromatiinin huomattiin kuitenkin sijoittuvan kauemmas tuman pinnasta aktiinin depolymerisaation seurauksena.
Päätelmät:
Onnistunut solulinjan pystytys ja sen avulla tehdyt kokeet viittasivat siihen, että DamID-systeemi on käyttökelpoinen epiteelisoluissa. Saadun tulokset osoittivat, että lamiini A/C:n kanssa vuorovaikuttava kromatiini on transkriptionaalisesti hiljennettyä. Myrkkykokeiden mukaan aktiinivälitteinen mekaaninen voima ei suoraan heijastu kromatiiniin lamiini A/C:n kautta, mutta saattaa olla vastuussa kromatiinin kiinnittymisestä tumakalvolle. Tutkimuksissa selvisi myös, että mekaanisella voimalla on vaikutus Lamiini A/C:n rakenteelliseen organisaatioon epiteelisoluissa.