Novel cornea-specific bioink for 3D bioprinting

Abstract

Background and aims: Healthy cornea is transparent which is crucial for its role in light transmission and refraction. The corneal stroma (CS) constitutes a significant portion of cornea and its complex architecture, playing a major role in corneal transparency. The CS is populated by corneal keratocytes (CKs), which maintain the CS. As the cornea is the most anterior part of the eye it is susceptible to injuries and diseases, which disrupt the native corneal organization. This is associated with a decrease in corneal transparency and vision, referred to as corneal blindness. Currently, the choice of treatment for corneal blindness patients is corneal transplantation. However, there is a global shortage of donor corneas, thus only a fraction of patients can benefit from this treatment. Keratoprostheses (KPros) can be used instead, however these come with significant limitations. Previously, conventional corneal tissue engineering (TE) methods have been used to address this problem. However, it is not possible to mimic the corneal structure with these methods. Three-dimensional (3D) bioprinting has recently gained attention as a novel approach to generate transplantable corneal equivalents. The aim of this thesis was to develop a cornea-specific bioink for extrusion-based bioprinting (EBB) and to study the printability and biocompatibility of the bioink.

Materials and methods: Human adipose tissue stem cells (hASCs) were differentiated towards CKs (hASC-CKs), which were used to produce cornea-specific cell-derived matrix (Co-CDM). The presence of corneal extracellular matrix proteins (ECM) in the Co-CDM was studied with immunofluorescence staining. Macromolecular crowding (MMC) conditions were used to study if the amount of produced Co-CDM can be increased. In order to incorporate the Co-CDM into the bioink it was decellularized, hence the name Co-dCDM, and processed. In this thesis the characteristics of Co-dCDM bioink were compared to a bioink which had similar composition, containing collagen I (Col I) instead of Co-dCDM. Then, the bioink compositions and printing parameters were optimized. Characterized bioink properties were printability, shape fidelity, swelling behavior and viscosity. In the final step of the thesis Co-dCDM bioink was printed with hASCs and biocompatibility was studied by measuring cell viability and proliferation.

Results and conclusions: The immunofluorescence stainings of hASC-CKs showed expression of CK specific marker proteins in the Co-CDM. The studied MMC culture conditions did not increase the amount of produced Co-CDM, since it led to cell detachment. Decellularization of the produced Co-CDM resulted in a clear decrease in the DNA content, although the inclusion of DNase 1 did not improve decellularization efficacy compared to decellularization without DNase 1. The Co-dCDM bioink showed good printability and shape fidelity post-printing. Transparency of Co-dCDM was excellent, although it was greater for Col I bioink. In viscosity measurements Co-dCDM demonstrated the desirable shear-thinning property for EBB. The biocompatibility of Co-dCDM was excellent since hASCs were viable and proliferative in the bioink. Similarly, immunofluorescence staining’s showed expression of proliferation marker Ki-67 and elongated morphology of hASCs. This is the first study where a cornea-specific bioink, incorporating Co-dCDM instead of decellularized cornea, is developed and characterized. The Co-dCDM demonstrated beneficial properties and thus it should be studied more closely in the future to evaluate its potential for corneal 3D bioprinting applications.

Tausta ja tavoitteet: Terve sarveiskalvo on läpinäkyvä, mikä on välttämätöntä sarveiskalvon roolille valon läpäisevyydessä ja taitossa. Sarveiskalvon strooma käsittää merkittävän osan sarveiskalvosta ja sen monimutkaisesta rakenteesta. Sarveiskalvon keratosyytit ylläpitävät tätä ja ovat merkittävässä roolissa sarveiskalvon läpinäkyvyyden ylläpitämisessä. Sarveiskalvo on altis vaurioille ja taudeille, koska se on silmän etummaisin osa. Nämä tuhoavat sarveiskalvon luontaisen rakenteen, mihin liittyy sarveiskalvon läpinäkyvyyden vähentyminen ja sokeutuminen. Sarveiskalvon siirto on yleisin hoitokeino potilaille, jotka kärsivät sarveiskalvon vaurioitumisesta aiheutuvasta sokeutumisesta. Kuitenkin maailmanlaajuisesta sarveiskalvosiirteiden pulasta johtuen vain pieni osa potilaista voidaan hoitaa. Keratoproteesit ovat vaihtoehtoinen hoitokeino sarveiskalvon siirrolle, mutta niihin liittyy merkittäviä rajoitteita. Aiemmin perinteisiä kudosteknologian menetelmiä on käytetty sarveiskalvopulan ratkaisemiseksi. Näillä menetelmillä ei kuitenkaan ole mahdollista jäljitellä sarveiskalvon luontaista rakennetta. Viime aikoina kolmiulotteinen (3D) biotulostus on saanut huomiota uudenlaisena lähestymistapana tuottaa sarveiskalvon kaltaisia siirrännäisiä. Tämän työn tavoite oli kehittää sarveiskalvospesifinen extruusio 3D biotulostettava biomuste ja tutkia sen tulostettavuutta ja bioyhteensopivuutta.

Materiaalit ja menetelmät: Ihmisen rasvakudoksen kantasolut (human adipose tissue stem cells, hASCs) erilaistettiin keratosyyttien kaltaisiksi soluiksi, joita käytettiin sarveiskalvospesifisen soluperäisen matriisin (cornea-specific cell-derived matrix, Co-CDM) tuottamiseen. Immunofluoresenssi värjäyksillä tutkittiin sarveiskalvon soluväliaineen proteiinien olemassaoloa Co-CDM:sta. Makromolekulaarisella täytöllä (Macromolecular crowding, MMC) tutkittiin vaikutusta tuotetun Co-CDM määrään. Ennen Co-CDM:n sekoittamista biomusteeseen, se desellularisoitiin, josta tuli nimi Co-dCDM. Tässä työssä vertailtiin kahden biomusteen ominaisuuksia, joilla oli muuten sama koostumus, paitsi yksi sisälsi Co-dCDM:ta ja toinen kollageeni I:ta. Sitten biomusteiden koostumukset ja tulostusolosuhteet optimoitiin. Biomusteista tutkitut ominaisuudet olivat tulostettavuus, filamenttien muodon pysyvyyttä, turpoaminen ja leikkausohenevuus. Lopuksi työssä tulostettiin hASCs-soluja Co-dCDM-biomusteen kanssa. Biomusteen bioyhteensopivuutta tutkittiin mittaamalla solujen elinkelpoisuutta ja proliferaatiota.

Tulokset ja päätelmät: Immunofluoresenssi värjäyksissä havaittiin, että hASC-CKs-solujen tuottamassa Co-CDM:ssa expressoitui keratosyyttispesifisiä proteiinimarkereita. Lisäksi MMC-olosuhteet eivät lisänneet tuotetun Co-CDM:n määrää, koska se johti solujen irtoamiseen. Desellularisaatio vähensi Co-CDM:n sisältämän DNA:n määrää, mutta DNase 1:n lisäys ei parantanut desellularisaatiota. Co-dCDM-biomusteen tulostettavuus ja filamenttien muodon pysyvyys tulostamisen jälkeen olivat hyvät. Lisäksi biomusteen läpinäkyvyys oli erinomainen, vaikkakin se oli matalampi kuin Col I-biomusteella. Viskositeettimittauksissa havaittiin, että Co-dCDM-biomuste oli leikkausohenevaa. Tämä on haluttu ominaisuus extruusio 3D biotulostuksessa käytettäville biomusteille. Myös Co-dCDM-biomusteen bioyhteensopivuus oli erinomainen, sillä hASCs olivat elinkelpoisia ja proliferatiivisia biomusteessa. Tämän lisäksi tulostettujen rakenteiden immunofluoresenssivärjäyksissä havaittiin proliferaatiomarkkerin Ki-67 expressio ja hASCs-solujen pitkänomainen morphologia. Tämä on ensimmäinen tutkimus, missä sarveiskalvospesifinen biomuste on kehitetty käyttämättä desellularisoituja sarveiskalvoja. Tutkitulla Co-dCDM-biomusteella oli lupaavia ominaisuuksia ja sitä tulisi tutkia lisää, jotta saadaan enemmän tietoa sen koostumuksesta ja potentiaalista 3D-biotulostuksessa.