Studying the survival of the mutant zebrafish embryos during mycobacterial infection
Saarimaa, Sini (2022)
2022
Bioteknologian ja biolääketieteen tekniikan kandidaattiohjelma - Bachelor's Programme in Biotechnology and Biomedical Engineering
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. Only for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2022-05-03
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202204253493
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202204253493
Tiivistelmä
Tuberculosis is a worldwide health issue that affects over ten million people’s lives every year. The lack of effective prevention methods and treatments makes tuberculosis a dangerous disease. Suitable animal models are needed to promote tuberculosis research. Zebrafish (Danio rerio) is a promising animal model because of its natural pathogen Mycobacterium marinum (M. marinum). Human tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) which is a genetically similar pathogen to M. marinum of the zebrafish. Humans and zebrafish are anatomically very different, but their mycobacterial infections share the same main features. Both pathogens infect macrophages, and the progress of the infection is almost similar in both species.
This thesis studied the survival of the mutant zebrafish embryos during mycobacterial infection. Two different survival experiments, one for the AB wild type fish and another for the unc-119 homolog b (C. elegans) (unc119b) mutant fish, were made. The unc119b fish of this thesis had a mutation in their unc119b gene. The main aim of this study is to find out how the knockout of the unc119b gene affected the survival of the embryos during mycobacterial infection. Another objective of this thesis is to study only the functions of the innate immune system of the embryos against mycobacterial infection because the adaptive immune response of the embryos is not functional until four to six weeks after fertilization. The third objective is to study how the infection proceeds and appears outwards in zebrafish embryos.
In this thesis, the zebrafish embryos were infected with M. marinum on the fertilization day. There were also control groups without bacterial injection. The survival of embryos/larvae was followed for 7 or 8 days. All zebrafish that showed any signs of mycobacterial infection outwards were euthanized by following the humane endpoint criteria. In the unc119b experiment, the fish were also genotyped, and the genotyping consisted of DNA extraction, polymerase chain reaction (PCR), agarose gel electrophoresis (AGE), purification of the PCR product with enzymatic treatment and sequencing.
In both experiments, the fish died from M. marinum infection. In the AB wild type experiment, the infection proceeded as expected but in the unc119b mutant experiment, the fish died less than usually. Kaplan-Meier survival analyses were made for both experiments. Based on the unc119b fish survival analysis, the mutation in the unc119b gene did not affect significantly the survival of the embryos/larvae in this thesis. In both experiments, all groups infected with M. marinum had a weaker survival than the control groups without mycobacteria.
The information gained from the survival experiments of this thesis can be taken advantage of in further studies. In the future, more studies are needed to study how the lack of the functional unc119b gene affects the survival of the zebrafish embryos. One purpose of this thesis is to promote the discovery of new ways to treat the global health issue, tuberculosis. Tuberkuloosi on maailmanlaajuinen terveysongelma, joka vaikuttaa yli kymmenen miljoonan ihmisen elämään vuosittain. Tehokkaiden ehkäisy- ja hoitomenetelmien puute tekee tuberkuloosista vaarallisen taudin. Sopivia eläinmalleja tarvitaan tuberkuloosin tutkimuksen edistämiseen. Seeprakala (Danio rerio) on lupaava eläinmalli sen luonnollisen patogeenin, Mycobacterium marinumin (M. marinum) vuoksi. Ihmisten tuberkuloosin aiheuttaa Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), joka on geneettisesti samankaltainen patogeeni seeprakalojen M. marinumin kanssa. Vaikka ihmiset ja seeprakalat ovat anatomialtaan hyvin erilaisia, niiden mykobakteeri-infektiot jakavat samat pääpiirteet. Molemmat patogeenit infektoivat makrofageja ja infektio etenee lähes samalla tavalla molemmissa lajeissa.
Tässä tutkielmassa mutatoiduille seeprakalan alkioille tehtiin selviytymisanalyysi mykobakteeri-infektion aikana. Tutkielmassa tehtiin kaksi erillistä selviytymiskoetta, toinen villityypin AB-kaloille ja toinen mutanteille unc-119 homologi b (C. elegans) (unc119b) –kaloille. Tämän tutkimuksen unc119b –kaloilla oli mutaatio unc119b –geenissä. Tutkimuksen päätavoite on selvittää, kuinka unc119b –geenin puuttuminen vaikuttaa seeprakalan poikasten selviytymiseen mykobakteeri-infektiosta. Tutkimuksen toinen tavoite on tutkia pelkästään poikasten synnynnäisen immuniteetin toimintaa mykobakteeri-infektiossa, sillä poikasten hankittu immuniteetti on toiminnallinen vasta 4–6 viikon kuluttua hedelmöityksestä. Kolmas tavoite on tutkia, kuinka infektio etenee ja näkyy ulospäin seeprakalan poikasissa.
Tässä tutkimuksessa seeprakalan alkiot infektoitiin Mycobacterium marinum -bakteerilla niiden hedelmöittymispäivänä. Tutkimuksessa oli mukana myös kontrolliryhmiä, joita ei infektoitu bakteerilla. Alkioiden selviytymistä infektiosta seurattiin 7 tai 8 päivää. Tutkimuksen aikana kaikki poikaset, joissa näkyi mykobakteeri-infektion merkkejä, lopetettiin humane endpoint –kriteerien mukaisesti. Unc119b –kaloille selvitettiin myös alkioiden genotyyppi. Genotyypitys koostui DNA-eristyksestä, polymeraasiketjureaktiosta (PCR), agaroosigeelielektroforeesista (AGE), PCR-tuotteiden pudistamisesta entsyymien avulla sekä sekvensoinnista.
Seeprakalat kuolivat M. marinum –infektioon molemmissa selviytymiskokeissa. Villityypin AB-kaloissa infektio eteni odotetusti, mutta mutantit unc119b –kalat kuolivat infektioon vähemmän kuin yleensä. Tuloksista tehtiin Kaplan-Meier selviytymisanalyysi ja tämän selviytymisanalyysin perusteella unc119b –geenin mutaatio ei vaikuttanut merkittävästi poikasten selviytymiseen infektiosta. Molemmissa selviytymiskokeissa kaikkien mykobakteerilla infektoitujen kalojen selviytyminen oli heikompaa verrattuna kontrolliryhmiin, joita ei infektoitu mykobakteerilla.
Tämän tutkielman selviytymisanalyysien avulla saatua tietoa voidaan hyödyntää tulevissa tutkimuksissa. Tulevaisuudessa tarvitaan myös lisää tutkimuksia, jotta voidaan selvittää, kuinka unc119b –geenin toimimattomuus vaikuttaa mutatoitujen seeprakalan alkioiden selviytymiseen M. marinum –infektiosta. Yksi tämän tutkimuksen tarkoituksista on edistää uusien hoitokeinojen löytämistä maailmanlaajuista terveysongelmaa, tuberkuloosia vastaan.
This thesis studied the survival of the mutant zebrafish embryos during mycobacterial infection. Two different survival experiments, one for the AB wild type fish and another for the unc-119 homolog b (C. elegans) (unc119b) mutant fish, were made. The unc119b fish of this thesis had a mutation in their unc119b gene. The main aim of this study is to find out how the knockout of the unc119b gene affected the survival of the embryos during mycobacterial infection. Another objective of this thesis is to study only the functions of the innate immune system of the embryos against mycobacterial infection because the adaptive immune response of the embryos is not functional until four to six weeks after fertilization. The third objective is to study how the infection proceeds and appears outwards in zebrafish embryos.
In this thesis, the zebrafish embryos were infected with M. marinum on the fertilization day. There were also control groups without bacterial injection. The survival of embryos/larvae was followed for 7 or 8 days. All zebrafish that showed any signs of mycobacterial infection outwards were euthanized by following the humane endpoint criteria. In the unc119b experiment, the fish were also genotyped, and the genotyping consisted of DNA extraction, polymerase chain reaction (PCR), agarose gel electrophoresis (AGE), purification of the PCR product with enzymatic treatment and sequencing.
In both experiments, the fish died from M. marinum infection. In the AB wild type experiment, the infection proceeded as expected but in the unc119b mutant experiment, the fish died less than usually. Kaplan-Meier survival analyses were made for both experiments. Based on the unc119b fish survival analysis, the mutation in the unc119b gene did not affect significantly the survival of the embryos/larvae in this thesis. In both experiments, all groups infected with M. marinum had a weaker survival than the control groups without mycobacteria.
The information gained from the survival experiments of this thesis can be taken advantage of in further studies. In the future, more studies are needed to study how the lack of the functional unc119b gene affects the survival of the zebrafish embryos. One purpose of this thesis is to promote the discovery of new ways to treat the global health issue, tuberculosis.
Tässä tutkielmassa mutatoiduille seeprakalan alkioille tehtiin selviytymisanalyysi mykobakteeri-infektion aikana. Tutkielmassa tehtiin kaksi erillistä selviytymiskoetta, toinen villityypin AB-kaloille ja toinen mutanteille unc-119 homologi b (C. elegans) (unc119b) –kaloille. Tämän tutkimuksen unc119b –kaloilla oli mutaatio unc119b –geenissä. Tutkimuksen päätavoite on selvittää, kuinka unc119b –geenin puuttuminen vaikuttaa seeprakalan poikasten selviytymiseen mykobakteeri-infektiosta. Tutkimuksen toinen tavoite on tutkia pelkästään poikasten synnynnäisen immuniteetin toimintaa mykobakteeri-infektiossa, sillä poikasten hankittu immuniteetti on toiminnallinen vasta 4–6 viikon kuluttua hedelmöityksestä. Kolmas tavoite on tutkia, kuinka infektio etenee ja näkyy ulospäin seeprakalan poikasissa.
Tässä tutkimuksessa seeprakalan alkiot infektoitiin Mycobacterium marinum -bakteerilla niiden hedelmöittymispäivänä. Tutkimuksessa oli mukana myös kontrolliryhmiä, joita ei infektoitu bakteerilla. Alkioiden selviytymistä infektiosta seurattiin 7 tai 8 päivää. Tutkimuksen aikana kaikki poikaset, joissa näkyi mykobakteeri-infektion merkkejä, lopetettiin humane endpoint –kriteerien mukaisesti. Unc119b –kaloille selvitettiin myös alkioiden genotyyppi. Genotyypitys koostui DNA-eristyksestä, polymeraasiketjureaktiosta (PCR), agaroosigeelielektroforeesista (AGE), PCR-tuotteiden pudistamisesta entsyymien avulla sekä sekvensoinnista.
Seeprakalat kuolivat M. marinum –infektioon molemmissa selviytymiskokeissa. Villityypin AB-kaloissa infektio eteni odotetusti, mutta mutantit unc119b –kalat kuolivat infektioon vähemmän kuin yleensä. Tuloksista tehtiin Kaplan-Meier selviytymisanalyysi ja tämän selviytymisanalyysin perusteella unc119b –geenin mutaatio ei vaikuttanut merkittävästi poikasten selviytymiseen infektiosta. Molemmissa selviytymiskokeissa kaikkien mykobakteerilla infektoitujen kalojen selviytyminen oli heikompaa verrattuna kontrolliryhmiin, joita ei infektoitu mykobakteerilla.
Tämän tutkielman selviytymisanalyysien avulla saatua tietoa voidaan hyödyntää tulevissa tutkimuksissa. Tulevaisuudessa tarvitaan myös lisää tutkimuksia, jotta voidaan selvittää, kuinka unc119b –geenin toimimattomuus vaikuttaa mutatoitujen seeprakalan alkioiden selviytymiseen M. marinum –infektiosta. Yksi tämän tutkimuksen tarkoituksista on edistää uusien hoitokeinojen löytämistä maailmanlaajuista terveysongelmaa, tuberkuloosia vastaan.