Novel targeted inhibitors for JAK1 and JAK3 tyrosine kinases

Abstract

Janus kinases (JAKs) are a family of tyrosine kinases that are important in inflammation. Janus kinase inhibitors are used to treat autoimmune and inflammatory diseases like rheumatoid arthritis and inflammatory bowel disease. JAK activity is mediated by the tyrosine kinase domain (JH1) which is regulated by the pseudokinase domain (JH2). All the clinical JAK inhibitors on the market target the JH1, which is more conserved than JH2. Most of the current clinical JAK inhibitors are not specific to one JAK but instead inhibit the activity of many or all of the JAKs. The aim of this thesis was to find an inhibitor, that inhibits the JAK activity by binding to JH2 domain instead. This way the inhibition could be specific to either JAK1 or JAK3, reducing side-effects by better targeting the cytokine signalling that is inhibited. In this thesis, a group of potential JH2 binders were investigated. Some of them were hits from previous smw screenings, but some were identified through a virtual screen and characterized as part of this thesis. The potential JH2 binders for JAK1 or JAK3 were studied fortheir binding specificity and inhibition. Inhibition was studied by Lance Ultra, which analysed the JH1 kinase activity in the context of JH2 regulation, and by cytokine signalling studies which analysed the inhibition of downstream signalling in cellular context. Three compounds, Omipa, Picti and 4G were identified as potential JAK1 JH2 specific binders, and two compounds, Mito and F165 also showed TYK2 JH2 binding along with JAK1 JH2 binding. The compounds did not show inhibition in kinase activity assay but did show inhibition of downstream signalling of either IL6 or IL4. Due to technical issues in cytokine signalling assay, these results need to be replicated in order to validate the findings. The assay could be improved by optimizing the freezing process of the cells or by using unfrozen cell and by optimizing fluorescence barcoding.

Janus kinaasit (JAK) ovat tyrosiinikinaasi perhe jotka ovat tärkeitä tulehduksessa. Janus kinaasien inhibiittoreita käytetään autoimmuuni- ja tulehduksellisten sairauksien kuten nivelreuman ja tulehduksellisten suolistosairauksien hoitoon. JAK aktiivisuutta välittää tyrosiinikinaasi osa (JH1) jota säätelee pseukokinaasidomeeni (JH2). Kaikki markkinoilla olevat kliiniset JAK inhibiittorit sitoutuvat JH1-osaan joka on konservoituneempi kuin JH2i. Useimmatkäytössä olevat kliiniset JAK inhibiittorit eivät ole spesifisiä yhdelle JAK:ille, vaan inhiboivat monien tai kaikkien JAK:ien aktiivisuutta. Tämän opinnäytetyön tavoiteena oli löytää inhibiittori, joka inhiboi JAK aktiivisuutta sitoutumalla JH2 osaan. JH2 välitteinen inhibitio voisi olla spesifistä joko JAK1:lle tai JAK3:lle, vähentäen sivuvaikutuksia kohdentamalla paremmin inhiboitua sytokiinisignalointia. Tässä opinnäytetyössä tutkittiin ryhmää potentiaalisia JH2 sitoutuja. Osa niistä oli löydöksiä aiemmista virtuaaliseulonnoista, mutta osa tunnistettiin virtuaalisessa seulonnassa, joka on sisällytetty tähän opinnäytetyöhön. Potentiaalisista JAK1 tai JAK3 JH2 sitoutujista tutkittiin sitoutumisen spesifisyys ja inhibitio. Inhibition tutkittiin käyttämällä Lance Ultraa, mikä tutkii JH1:n kinaasiaktiivisuutta yhdessä JH2:n säätelyn kanssa. Inhibitiota tutkittiin myös sytokiinisignalointia tutkimalla, mikä tarkastelee solusignaloinnin inhibitiota. Kolme yhdistettä, Omipa, Picti ja 4G tunnistettiin potentiaalisiksi JAK1 JH2 spesifisiksi sitoutujiksi ja kaksi yhdistettyä, Mito ja F165 osoittivat lisäksi myös TYK2 JH2 sitoutumistai. Nämä yhdisteet eivät osoittaneet inhibitiota kinaasiaktiivisuuden tarkastelussa, mutta osoittivat joko IL6:n tai IL4:n alavirran signaloinnin inhibitiota. Johtuen teknisistä ongelmista sytokiinisignalointikokeissa, nämä tulokset tulee toistaa löydösten validoimiseksi. Sytokiinisignalointikoetta voisi kehittää optimoimalla solujen jäädytystä tai käyttämällä tuoreita soluja sekä optimoimalla fluoresenssi barkoodausta.