Macrophage and Chondrocyte Phenotypes in Inflammation

Abstract

Ihmiskehon useat solutyypit voivat omaksua erilaisia ilmiasuja (fenotyyppejä) reaktiona ympäristön signaaleihin. Eräs parhaiten tunnetuista tätä ilmiötä kuvaavista esimerkeistä on ns. auttaja-T-lymfosyyttien (TH-solujen) TH1/TH2/TH17- ilmiasujako. Vastaavanlainen jako, makrofagipolarisaatio, on kehitetty kuvaamaan makrofagien ilmiasuja. ”Klassisesti aktivoituneet” eli M1-makrofagit edistävät tulehdusta, ”vaihtoehtoisesti aktivoituneet” M2-makrofagit puolestaan hillitsevät sitä. Useiden eri tekijöiden, kuten sytokiinien, solunsisäisten signalointireittien, metabolisten tekijöiden ja lääkkeiden, on osoitettu vaikuttavan makrofagien ilmiasuun.

Nivelrikko on yleinen ja vaikeahoitoinen tauti, jolle on tyypillistä nivelen krooninen, matala-asteinen tulehdustila. Geenien ilmentymisen nivelruston soluissa, kondrosyyteissä, on havaittu muuttuvan tautiprosessin edetessä. Nämä muutokset, ja niiden vasteet erilaisiin elimistön sisäisiin tekijöihin ja lääkityksiin, tunnetaan kuitenkin puutteellisesti. Tässä väitöskirjassa esitettiin hypoteesi, jonka mukaan rustosolut omaksuvat erilaisia ilmiasuja erilaisten tulehdustekijöiden ja lääkkeiden vaikutuksesta.

Tämän väitöskirjan osatyössä I tutkimme tunnetun tulehdusreaktiota hillitsevän tekijän, MAP-kinaasifosfataasi 1:n (MKP-1:n), vaikutuksia M2- makrofagiaktivaatioon. MKP-1-puutteisilla hiirillä useiden M2-makrofageille tyypillisten geenien ilmentyminen oli villityypin hiiriä vähäisempää. Lisäksi glukokortikoidi deksametasonin vaikutukset sekä tyypillisiin M1- että M2-geeneihin olivat MKP-1-puutteisten hiirten makrofageissa villityyppiä vähäisempiä. Nämä tulokset osoittavat, että MKP-1 ei ainoastaan hillitse M1-aktivaatiota, vaan ”siirtää” makrofagiaktivaatiota tulehdusta rauhoittavaan M2-suuntaan, ja että glukokortikoidien vaikutukset makrofageissa välittyvät ainakin osittain MKP-1:n kautta.

Osatyössä II tutkimme nortrakelogeniinin, männyn (Pinus sylvestris) sisäoksauutteen merkittävän lignaanikomponentin, vaikutuksia makrofagien ilmiasuun. Yhdiste hillitsi M2-aktivaatiota ja vaimensi ihofibroosin kehittymistä skleroderman kokeellisessa mallissa. Tämä viittaa siihen, että nortrakelogeniini voisi olla hyödyllinen yhdiste fibrotisoivien sairauksien hoidossa.

Osatyössä III nivelrikkopotilailta eristettyjä rustosoluja käsiteltiin keskeisillä TH1/TH2/TH17-sytokiineillä, ja tavoitteena oli tutkia näiden sytokiinien vaikutuksia rustosolujen ilmiasuun. IL-1β:llä käsitellyissä soluissa [C(IL-1β)-rustosoluissa] useiden tulehdusta edistävien ja katabolisten geenien ilmentyminen oli lisääntynyt. C(IL-17)-ilmiasussa oli indusoitunut rajatumpi joukko tulehdusta edistäviä geenejä. C(IFNψ)-ilmiasu poikkesi varsin paljon kahdesta edellisestä; useiden antigeenien käsittelyyn ja esittelyyn liittyvien geenien ilmentyminen oli siinä lisääntynyt. C(IL-4)- ilmiasussa varsin pienen geenijoukon ilmentyminen erosi kontrollisoluista. Erityisesti tulehdusta hillitsevien, TGFβ-signalointiin osallistuvien ja solunjakautumiseen liittyvien geenien ilmentymisessä havaittiin muutoksia C(IL-4)-rustosoluissa kontrollisoluihin verrattuna.

Osassa IV tutkittiin glukokortikoidien vaikutuksia rustosolujen ilmiasuun. Nivelensisäisiä glukokortikoidiruiskeita käytetään laajalti nivelrikon pahenemisvaiheiden hoidossa, mutta niiden pitkäaikaisvaikutukset rustoon ja taudin etenemiseen ovat pitkälti tuntemattomia. Nivelrikkorustosta eristetyissä rustosoluissa deksametasoni vaikutti merkittävästi suuren geenijoukon ilmentymiseen; yli 1200 geenissä havaittiin yli kaksinkertainen, tilastollisesti merkitsevä ilmentymisero deksametasonille altistettujen ja kontrollisolujen välillä. Näihin kuului mm. tulehdusreaktioon, rustomatriksin synteesiin ja hajoamiseen sekä lipidi- ja hiilihydraattimetaboliaan liittyviä geenejä. Kun tuloksia verrattiin aiempiin genominlaajuisiin ilmentymisanalyysitutkimuksiin, joissa oli tutkittu geenien ilmentymisen eroja vaurioituneen ja makroskooppisesti normaalin nivelrikkoruston välillä, deksametasonin havaittiin osittain muokkaavan rustosolujen ilmiasua vaurioituneesta rustosta normaalimman ruston suuntaan. Tulokset osoittavat, että glukokortikoideilla on laaja-alaisia vaikutuksia nivelrikkopotilaan rustosolujen ilmiasuun, ja että ne osin normalisoivat rustosolujen geeniekspressiota vaurioituneesta rustosta normaalimman ruston suuntaan.

Osassa V tutkimme laajasti käytetyn tulehduskipulääke ibuprofeenin vaikutuksia rustosolujen ilmiasuun. Ibuprofeenilla ei ollut yksin merkitsevää vaikutusta geenien ilmentymiseen, mutta kun soluja stimuloitiin tulehdusta edistävällä sytokiini IL-1β:lla, ibuprofeeni vaikutti selvästi (aiheutti yli 1.5-kertaisen muutoksen) 93 geenin ilmentymiseen. Useiden tulehdusta hillitsevien (kuten PPARG:n and IL10RA:n) ja soluadheesioon liittyvien geenien ilmentyminen lisääntyi, kun taas useiden tulehdustekijöiden (kuten IL23A:n and IL6:n) ilmentyminen väheni.

Väitöstutkimuksen tulokset osoittavat, että sekä makrofagit että rustosolut ilmentävät erilaisia ilmiasuja tulehdusreaktiossa. Ilmiasut voivat myös muuttua lääkkeiden ja ympäristötekijöiden vaikutuksesta. Tässä väitöstutkimuksessa esitellään ensimmäistä kertaa keskeisten TH1/TH2/TH17-sytokiinien indusoimat rustosolujen ilmiasut. Nivelrikossa laajalti käytettyjen lääkkeiden, glukokortikoidien ja tulehduskipulääkkeiden, vaikutuksia nivelrikkopotilailta eristettyihin rustosoluihin tutkittiin, ja näiden lääkkeiden indusoimat rustosolujen ilmiasut kuvattiin ensimmäistä kertaa. Tulokset lisäävät tietämystämme makrofagien ja rustosolujen merkityksestä tulehduksessa ja lääkevaikutuskohteina. Ne myös tarjoavat lähtöpisteen tarkemmille, hypoteesiohjatuille tutkimuksille.

In the human body, several cell types can adopt different phenotypes in response to their environment. One of the most well-established examples of this heterogeneity is the TH1/TH2/TH17 paradigm of T helper lymphocytes. An analogous paradigm is the macrophage polarization, which has the proinflammatory “classically activated” (M1) macrophages on the one end of the continuum and the anti-inflammatory “alternatively activated” (M2) cells on the other. Several different factors, such as endogenous cytokines, intracellular signaling mechanisms, metabolic factors and medications, may modulate macrophage phenotype.

Osteoarthritis (OA) is a common and hard-to-treat disease characterized by the presence of chronic low-grade inflammation in the affected joint. Chondrocytes, the cells of articular cartilage, are known to undergo changes in their gene expression in OA. However, these changes, as well as their response to endogenous factors and exogenous therapeutics, are only partially known. In this thesis, it was hypothesized that chondrocytes adopt distinct phenotypes induced by different endogenous and exogenous factors.

Part I of this study concerns the effects of mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphatase 1 (MKP-1), which has previously been shown to attenuate inflammation, on M2 macrophage activation. In macrophages from MKP-1 deficient mice, the expression of M2 markers was reduced compared to cells from wild-type animals. Furthermore, the effects of the glucocorticoid dexamethasone on both M1 and M2 markers were attenuated in macrophages from MKP-1 deficient mice. These results show that instead of merely attenuating M1 activation, MKP-1 actually “shifts” macrophage phenotype towards M2, and that the effects of glucocorticoids on macrophage phenotype are mediated, at least partly, via MKP-1.

In part II, effects of nortrachelogenin, a major lignan component of Pinus sylvestris knot extract, on macrophage phenotype were studied. Nortrachelogenin was found to attenuate alternative (M2) activation and to reduce bleomycin-induced dermal fibrosis in mice, indicating therapeutic potential in fibrosing diseases.

In part III, chondrocyte phenotypes induced by the central TH1/TH2/TH17 cytokines (IFNγ, IL-1, IL-4 and IL-17) were introduced by treating chondrocytes isolated from OA patients with these cytokines. Cells treated with IL-1β [C(IL-1β) chondrocyte phenotype] were characterized by the expression of a large number of proinflammatory and catabolic genes, while a smaller set of proinflammatory genes was induced in the C(IL-17) chondrocyte phenotype. The genes upregulated in the C(IFN) chondrocyte phenotype were relatively distinct from those induced by the two other proinflammatory cytokines and included those associated with antigen processing and presentation. In the C(IL-4) chondrocyte phenotype, a modest number of genes was differentially expressed compared with control chondrocytes. These genes were mostly those linked to regulation of inflammation, transforming growth factor beta (TGFβ) signaling and cell proliferation.

Part IV of the study describes the effects of glucocorticoids on chondrocyte phenotype. In OA chondrocytes, the glucocorticoid dexamethasone significantly and markedly (with fold change > 2.0) affected the expression of over 1200 genes associated with, among others, inflammation, cartilage anabolism and catabolism, as well as lipid and carbohydrate metabolism. When the results were compared with previous genome-wide expression analyses (GWEAs) studying chondrocyte transcriptome in degraded and preserved OA cartilage, dexamethasone was shown to partly shift chondrocyte gene expression profile from degraded towards preserved cartilage. As intra-articular glucocorticoid injections are widely used in the treatment of OA, these results show that glucocorticoids have wide-ranging effects on chondrocyte phenotype and partly normalize chondrocyte gene expression towards healthy cartilage. The results also inform future studies on the effects of glucocorticoids on cartilage health.

In part V, the effects of the widely used nonsteroidal anti-inflammatory drug ibuprofen on OA chondrocyte phenotype were studied. Ibuprofen alone had no significant effects on gene expression, but when given together with the proinflammatory cytokine IL-1β, a markedly differential expression (fold change > 1.5 in either direction) of 93 genes was observed. The upregulated genes included anti-inflammatory factors (such as PPARG and IL10RA) and genes associated with cell adhesion, while inflammatory factors such as IL23A and IL6 were among the downregulated genes.

The results demonstrate the ability of both macrophages and chondrocytes to adopt various phenotypes in inflammatory conditions and alter them in response to diverse medications and environmental factors. This study constitutes the first characterization of “polarized” chondrocyte phenotypes induced by the central TH1/TH2/TH17 cytokines. Also, the (OA) chondrocyte phenotypes induced by two widely used classes of OA medications, glucocorticoids and nonsteroidal anti- inflammatory drugs, were comprehensively characterized for the first time. The results enhance our understanding of the role of macrophages and chondrocytes in inflammation and as targets of drug development. They also provide a starting point for more detailed hypothesis-directed studies in the future.