Nanohydroxyapatite-supplemented methacrylated gelatin bioinks for three-dimensional bioprinting of bone

Abstract

Background and aims of the study: Bones have a regeneration capacity to a certain point, but critical-sized bone defects require treatment to heal the tissue. The increasing incidence of bone defects in the world has led to the need of more effective treatment strategies. Traditional treatment methods for bone defects are grafts or synthetic materials, but various limitations are related to their use. For instance, with grafts, high costs, risk for infections, and minor availability are issues related to their use. Tissue engineering focuses on approaches to replace or recover biological tissue. However, in the field of bone tissue engineering (BTE), the available artificial scaffolds do not mimic the natural bone and they usually have nonordered distribution of cells. Three-dimensional (3D) bioprinting is seen as a potential new solution in BTE to create personalized, organized, and bone-like constructs. However, lack of ideal bioinks is a considerable issue in 3D bioprinting, as various requirements related to cell function and printability of the bioinks exist. In this thesis, the aim was to develop a multicomponent bioink for extrusion-based 3D bioprinting for bone applications and to investigate the effect of nanohydroxyapatite (nHA) on printability and biological performance of the bioink. Great part of a natural bone tissue consists of nHA.

Materials and methods: The nHA concentrations in the bioinks were 0.0, 1.0, 3.0, and 5.0 % (weight/volume). First, the biomaterial inks, printing conditions, and ultraviolet (UV) light induced crosslinking were optimized by conducting a casting pilot and 3D printing pilots. The biomaterial inks were characterized for their material properties in terms of rheology, stability, and printability. Biological characterization composed of 3D bioprinting pilot, where human bone marrow derived mesenchymal stem cells (hBMSCs) were bioprinted in one bioink to optimize the crosslinking conditions in terms of cell viability and proliferation. After that, bioinks with different concentrations of nHA were 3D bioprinted and the viability, proliferation, morphology, and osteogenic differentiation of hBMSCs were examined with live/dead staining, proliferation assay, and immunostainings. Cytotoxicity of the materials and bioprinting process was evaluated by examining lactate dehydrogenase production by cells.

Results and conclusions: Longer UV exposure times tested in crosslinking decreased the cell viability and with all tested UV exposure times, the cell viability was decreased in first printed layers of the constructs. However, 45 second UV exposure time for each printed layer was found to be most functional and having minimal negative impact for the cells. In case of the bioink with 1 % nHA, enhanced cell viability and proliferation of hBMSCs was observed when compared to the other bioinks. This group had also excellent properties in terms of rheology, printability, and stability. Additionally, the bioink with 5 % nHA was found to have higher viscosity than with other bioinks, which had a negative impact on printability and biological responses of hBMSCs. Further studies are required, as, from made immunostainings, it was not possible to verify osteogenic differentiation of hBMSCs. In the future, the developed bioink with 1 % nHA together with UV crosslinking can potentially be used in 3D bioprinting for bone applications.

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Luut pystyvät uusiutumaan tiettyyn pisteeseen asti, mutta suuremmat luuvammat vaativat hoitoa kudoksen parantamiseksi. Luuvammojen lisääntynyt määrä maailmassa on johtanut tehokkaampien hoitomenetelmien tarpeeseen. Luusiirteet tai synteettiset materiaalit ovat perinteisiä hoitomenetelmiä luuvammoihin, mutta niiden käyttöön liittyy monia rajoituksia. Esimerkiksi luusiirteisiin liittyvät kustannukset, infektioriski ja heikko saatavuus ovat ongelmallisia. Kudosteknologia keskittyy lähestymistapoihin, jotka tähtäävät korvaamaan tai palauttamaan biologisen kudoksen. Luukudosteknologian alalla saatavilla olevat keinotekoiset skaffoldit eivät kuitenkaan vastaa luonnollista luuta, ja solujen jakautuminen niissä on tavallisesti järjestäytymätöntä. Kolmiulotteinen (3D) biotulostus nähdään lupaavana uutena ratkaisuna luukudosteknologiassa luoda yksilöllisiä, järjestäytyneitä ja luukudosta vastaavia rakenteita. Optimaalisten biomusteiden puute on kuitenkin suuri haaste 3D-biotulostuksessa, koska solujen toimintaan ja biomusteiden tulostettavuuteen liittyy monenlaisia vaatimuksia. Tässä opinnäytetyössä tavoitteena oli kehittää monikomponenttinen biomuste ekstruusioon perustuvalle 3D-biotulostukselle luusovelluksiin ja tutkia nanohydroksiapatiitin (nHA) vaikutusta biomusteen tulostettavuuteen ja biologiseen toimivuuteen. Suuri osa luonnollisesta luukudoksesta koostuu nanohydroksiapatiitista.

Materiaalit ja menetelmät: Biomusteiden nHA-pitoisuudet olivat 0.0, 1.0, 3.0 ja 5.0 % (paino/tilavuus). Ensiksi biomateriaalimusteet, tulostusolosuhteet ja materiaalin ristisilloittaminen ultravioletti (UV) -valolla optimoitiin tekemällä valantakokeilu ja 3D-tulostuspilotit. Biomateriaalimusteet karakterisoitiin keskittyen musteiden reologiaan, stabiilisuuteen ja tulostettavuuden. Biologisessa karakterisoinnissa, joka koostui 3D-biotulostuspilotista, ihmisen luuytimestä peräisin olevat mesenkymaaliset kantasolut biotulostettiin yhdessä biomusteista, ristisilloitusolosuhteiden optimoimiseksi solujen elinkelpoisuuden ja lisääntymisen kannalta. Sen jälkeen biomusteet eri nHA-pitoisuuksilla 3D-biotulostettiin ja solujen elinkelpoisuutta, jakaantumista, morfologiaa ja erilaistumista tutkittiin elävyys/kuolleisuus analyysilla, solujen jakaantumismäärityksellä ja immunofluoresenssivärjäyksillä. Materiaalien ja biotulostusprosessin sytotoksisuus arvioitiin tutkimalla solujen laktaattidehydrogenaasi-tuotantoa.

Tulokset ja johtopäätökset: Ristisilloituksessa testatut pidemmät UV-altistumisajat heikensivät solujen elinkelpoisuutta ja kaikilla testatuilla altistumisajoilla solujen elinkelpoisuus oli alhaisempi rakenteiden ensimmäiseksi tulostetuissa kerroksissa. Kuitenkin 45 sekunnin UV-altistumisaika kullekin tulostetulle kerrokselle osoittautui toimivimmaksi ja vaikutti mahdollisimman vähän soluihin. Biomusteessa, jossa nHA pitoisuus oli 1 %, solujen elinkyky ja jakaantuminen oli parempi verrattuna muihin biomusteisiin. Tällä ryhmällä oli myös erinomaiset ominaisuudet reologian, tulostettavuuden ja stabiilisuuden suhteen. Lisäksi 5 % nHA biomusteen viskositeetin todettiin olevan korkeampi kuin muissa biomusteissa, mikä vaikutti negatiivisesti musteen tulostettavuuteen ja solujen biologisiin vasteisiin. Lisätutkimuksia tarvitaan, koska tehdyistä immunofluoresenssivärjäyksistä ei ollut mahdollista todeta solujen erilaistumista. Kehitettyä 1 % nHA biomustetta ja UV-ristisilloitusta voidaan mahdollisesti tulevaisuudessa hyödyntää luusovelluksiin tähtäävässä 3D-biotulostuksessa.