Solunulkoisten vesikkelien fluoresenssileimaaminen ja puhdistaminen – menetelmien soveltuvuuden arviointi kokeellisesti

Abstract

Solunulkoiset vesikkelit (EV, engl. extracellular vesicle) ovat soluista kuroutuneita kalvopäällysteisiä partikkeleita, joiden on havaittu toimivan solujen välisinä viestinviejinä. Luontaisten kohdennusominaisuuksiensa vuoksi EV:iden mahdolliset lääketieteelliset sovellukset ovat olleet viime vuosina kiinnostuksen kohteena. EV:iden toimiminen lääkeaineiden kuljettajina voisi mahdollistaa kohdennetun lääkeaineen jakelun tiettyihin kudoksiin. EV:iden kulkeutumista soluihin voidaan tutkia fluoresenssimikroskopian keinoin, jolloin EV:t leimataan fluoresoivalla väriaineella. Leimaamisen jälkeen EV:isiin sitoutumaton väriaine on puhdistettava näytteestä. Leimaamisessa onkin tärkeää selvittää, päätyykö fluoresoiva väriaine todella EV:isiin ja selviytyvätkö EV:t vahingoittumattomina ylimääräisen väriaineen puhdistuksesta.

Tämä työ toimii katsauksena fluoresoivalla väriaineella leimatun EV-näytteen valmistamiseen eli leimaamiseen ja puhdistamiseen sitoutumattomasta väriaineesta. Työssä esitellään myös, miten leimattuja EV:itä voidaan karakterisoida leimaustehokkuuden ja selviytymisprosentin avulla. Työ sisältää kokeellisen tutkimuksen, jossa tutkittiin, kuinka hyvin valittu puhdistusmenetelmä, ultrasuodatus, soveltuu BODIPY-väriaineella leimattujen EV:iden puhdistamiseen. Työn pohjalta on mahdollista suorittaa koejärjestely, jolla voidaan tutkia eri leimaus- ja puhdistusmenetelmien soveltuvuutta EV:ille.

Kokeellisessa tutkimuksessa EV:t leimattiin passiivisella inkuboinnilla käyttäen fluoresoivaa BODIPY-väriainetta ja puhdistettiin ylimääräisestä väriaineesta ultrasuodattamalla 10 kDa huokoskoon ultrasuodatusputkilla. Työssä käytetyt solunulkoiset vesikkelit oli jaoteltu eristysvaiheessa eksosomeihin ja mikrovesikkeleihin sentrifugointivoiman perusteella ja tässä työssä käytetään kyseistä jaottelua. Puhdistuksen tehokkuutta arvioidaan fluoresenssispektroskopian keinoin ja EV:iden selviytymisprosentti määritetään NTA-mittausten (engl. Nanoparticle Tracking Analysis) perusteella.

Tutkimus osoittaa, että työssä käytetty leimausmenetelmä ja väriaine soveltuvat EV-näytteen leimaamiseen kohtalaisen hyvin ja näin valmistettua näytettä voitaisiin hyödyntää fluoresenssikuvantamistutkimuksissa. Laskettujen leimaustehokkuuksien perusteella vaikuttaa siltä, että väriaine todella päätyy EV:isiin. Ultrasuodatuksessa saannot jäivät kuitenkin hyvin pieniksi, mihin voi vaikuttaa puhdistuksen lisäksi esimerkiksi EV:iden selviytyminen kuljetuksesta, säilytyksestä ja käsittelystä. Jokin vaihtoehtoinen puhdistusmenetelmä voisi tuottaa paremman EV:iden selviytymisprosentin. Optimoimalla väriaineen määrää, puhdistuskertojen lukumäärää sekä muita puhdistusparametreja EV:iden selviytymisprosenttia voitaisiin saada myös ultrasuodatuksessa suuremmaksi kuin tässä työssä saavutetut prosentit.