3D Printed Axonal Diodes for Directed Axon Growth
Koistinen, Leena (2021)
Koistinen, Leena
2021
Biotekniikan DI-ohjelma - Master's Programme in Bioengineering
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. Only for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2021-06-02
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202105175080
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202105175080
Tiivistelmä
Human nervous system is divided into central and peripheral nervous systems consisting of highly organized neural cells which ensure signal propagation into certain directions between and inside the two systems. Basically, all the functions from sensing and movement to memory and emotions depend on the tightly controlled signal circuitry. Without orientation of the neural cells and their axons, the signals would propagate into arbitrary directions leading to severe dysfunctions.
Neural diseases and functions can be studied with in vitro cultures that mimic the native tissues and enable imaging and measurement of the cells. Especially transparent microfluidic devices casted of silicone are practical for neural models and measurements. In the devices, populations of cells are interconnected by the axons grown through microchannels.
Some neural regions, such as those found in the brain cortex conduct signals only into one direction due to unidirectionally oriented axons. To obtain the unidirectional circuitry in vitro, the geometry of the microchannels is specifically designed to prevent reverse axonal growth between the populations. Due to the high directional selectivity, these channels are called axonal diodes.
The objective of this Master of Science thesis was to design, fabricate, and characterize novel three-dimensional (3D) diodes in a previously developed microfluidic device consisting of three, linearly connected cell compartments. Similar “two-dimensional” (2D) diodes were also fabricated intended to function as a reference in future cell experiments for three different size 3D diodes, and the two fabrication processes were compared. If successful in replica molding, the 3D diodes should be tested with cells for further development.
The fabrication process of the new diodes is a combination of 3D printing based on two-photon polymerization (2PP), ultraviolet (UV) light-photolithography, stereolithography (SLA) 3D printing, and silicone replica molding. The wafer -based master molds comprised of the axonal diodes, cell compartments deposited with photolithographic techniques, and SLA 3D printed macroinserts providing open access to the compartments. The 3D diodes were fabricated with the 2PP-based 3D printing and the 2D diodes with photolithography. Characterization of the diodes was done using scanning electron microscopy, contact and optical profilometry, and fluorescent imaging. The accuracy and precision of the replica molding process were also evaluated.
The 2PP 3D printed diodes were compatible with the photolithography process and could be used for fabrication of the 3D diode devices by replica molding. The measured means of the xy-features of the replicated diodes indicated that the parameters used in 2PP 3D printing were more accurate in fabrication of the smallest features compared to the parameters used in photolithography but both the processes require optimization. To measure the z-features of the 3D diodes more accurately, optical profilometry should be tested for carbon coated devices. Features of the diodes should be measured from both the 2D and 3D molds to optimize the mold fabrication parameters.
The replica molding of the devices should be also developed. The major issues were microbubbles and tearing of the devices which resulted in yields between 17–43%. Vacuuming of the uncured silicone three times down to -0.7 bar in the mold and stabilization at atmospheric pressure should minimize the amount of bubbles. Tearing can be avoided with fresh fluorosilane coating and slow pulling when peeling off the silicone from the molds. Ihmisen hermojärjestelmä jaetaan keskus- ja ääreishermostoon, joiden sisäinen ja välinen toiminta perustuvat tarkoin järjestäytyneiden hermosolujen väliseen viestintään. Käytännössä kaikki toiminnot aisteista ja liikkeistä aina muistiin ja tunteisiin riippuvat hermokudoksen rakenteesta, jossa viestit kulkevat vain tiettyihin suuntiin solujen viejähaarakkeita eli aksoneja pitkin. Ilman aksoninen suuntautuneisuutta viestit kulkisivat mielivaltaisesti johtaen vakaviin toimintahäiriöihin.
Hermoston toimintaa ja neurologisia sairauksia voidaan tutkia in vitro -alustoilla, joissa keinotekoisesti kasvatettujen kehon kudoksia muistuttavien solurakenteiden toimintaa voidaan mitata ja kuvantaa. Hermotoiminnan mallintamiseen ja mittaamiseen sopivat erityisesti läpinäkyvät, silikonista valetut mikrofluidistiset laitteet, joissa eri solupopulaatiota yhdistävät mikrokanavia pitkin kasvavat aksonit.
Esimerkiksi aivokuoresta on löydetty alueita, joissa viestit kulkevat vain yhteen suuntaan yhdensuuntaisesti kasvaneita aksoneja pitkin. Mikrofluidistisen laitteen mikrokanavat voidaan erityisesti suunnitella estämään aksonien kasvua vastakkaisesta populaatiosta ja siten kasvattaa yhdensuuntaisia hermopiirejä laboratoriossa. Tarkoin valikoivan luonteensa vuoksi tällaisia kanavia kutsutaan aksonaalisiksi diodeiksi.
Diplomityön tavoitteena oli suunnitella, valmistaa ja karakterisoida aikaisemmin kehitettyyn mikrofluidistiseen laitteeseen uudenlaisia kolmiulotteisia (3D) diodeja, jotka yhdistävät kolme lineaarisesti paikoitettua solukammiota. Lisäksi työssä valmistettiin ”kaksiulotteisia” (2D) diodeja vertailukohdaksi solukokeisiin kolmelle erikokoiselle 3D-diodille ja eri diodityyppien valmistusprosesseja vertailtiin. Mikäli 3D diodeja voidaan valmistaa, niitä tulee testata soluilla jatkokehitystä varten.
Diodien valmistusprosessi on yhdistelmä kahden fotonin polymerisaatioon (2PP) perustuvaa 3D-tulostusta, optista ultraviolettivalo- (UV) litografiaa, stereolitografia- (SLA) 3D-tulostusta sekä silikonivalua. Valumuotti koostui piikiekolle valmistetuista diodeista, optisella litografialla valmistetuista solukammioista sekä SLA 3D-tulostetuista makroinserteistä, jotka valavat silikoniin avoimen pääsyn solukammioihin. 3D-diodit valmistettiin 2PP:ta hyödyntävällä 3D-tulostimella ja 2D-diodit optisella litografialla. Diodit karakterisoitiin pyyhkäisyelektronimikroskoopin, kontaktiprofilometrin, optisen profilometrin sekä fluoresenssikuvauksen avulla. Myös laitteiden valuprosessin tarkkuutta ja täsmällisyyttä arvioitiin.
2PP 3D-tulostetut diodit sopivat litografiaprosessointiin ja niillä voitiin valaa silikonisia 3D-diodilaitteita. Valettujen diodien xy-piirteille mitatut arvot viittasivat käytettyjen 2PP 3D-tulostusparametrien toimivan tarkemmin pienimpien piirteiden valmistuksessa verrattuna optisessa litografiassa käytettyihin parametreihin, mutta molemmat valmistusprosessit vaativat edelleen optimointia. 3D diodien z-piirteiden tarkempaan mittaamiseen tulee testata optista profilometriä hiilipinnoitetuille laitteille. Sekä 2D- että 3D-diodien piirteet tulee mitata myös muoteista valmistusparametrien optimoimiseksi.
Myös laitteiden valuprosessi vaatii kehitystä. Ongelmia tuottivat erityisesti mikrokuplat sekä laitteiden repeämät, joiden vuoksi muottien saannot olivat vain 17–43%. Kovettamattoman silikonin paineistus kolme kertaa -0.7 baariin sekä tasaaminen ilmanpaineessa saattavat ehkäistä kuplanmuodostusta. Repeytymistä voi ehkäistä muottien tuoreella fluorosilaanipinnoituksella ja poistamalla kovettunut silikoni hitaasti muotista.
Neural diseases and functions can be studied with in vitro cultures that mimic the native tissues and enable imaging and measurement of the cells. Especially transparent microfluidic devices casted of silicone are practical for neural models and measurements. In the devices, populations of cells are interconnected by the axons grown through microchannels.
Some neural regions, such as those found in the brain cortex conduct signals only into one direction due to unidirectionally oriented axons. To obtain the unidirectional circuitry in vitro, the geometry of the microchannels is specifically designed to prevent reverse axonal growth between the populations. Due to the high directional selectivity, these channels are called axonal diodes.
The objective of this Master of Science thesis was to design, fabricate, and characterize novel three-dimensional (3D) diodes in a previously developed microfluidic device consisting of three, linearly connected cell compartments. Similar “two-dimensional” (2D) diodes were also fabricated intended to function as a reference in future cell experiments for three different size 3D diodes, and the two fabrication processes were compared. If successful in replica molding, the 3D diodes should be tested with cells for further development.
The fabrication process of the new diodes is a combination of 3D printing based on two-photon polymerization (2PP), ultraviolet (UV) light-photolithography, stereolithography (SLA) 3D printing, and silicone replica molding. The wafer -based master molds comprised of the axonal diodes, cell compartments deposited with photolithographic techniques, and SLA 3D printed macroinserts providing open access to the compartments. The 3D diodes were fabricated with the 2PP-based 3D printing and the 2D diodes with photolithography. Characterization of the diodes was done using scanning electron microscopy, contact and optical profilometry, and fluorescent imaging. The accuracy and precision of the replica molding process were also evaluated.
The 2PP 3D printed diodes were compatible with the photolithography process and could be used for fabrication of the 3D diode devices by replica molding. The measured means of the xy-features of the replicated diodes indicated that the parameters used in 2PP 3D printing were more accurate in fabrication of the smallest features compared to the parameters used in photolithography but both the processes require optimization. To measure the z-features of the 3D diodes more accurately, optical profilometry should be tested for carbon coated devices. Features of the diodes should be measured from both the 2D and 3D molds to optimize the mold fabrication parameters.
The replica molding of the devices should be also developed. The major issues were microbubbles and tearing of the devices which resulted in yields between 17–43%. Vacuuming of the uncured silicone three times down to -0.7 bar in the mold and stabilization at atmospheric pressure should minimize the amount of bubbles. Tearing can be avoided with fresh fluorosilane coating and slow pulling when peeling off the silicone from the molds.
Hermoston toimintaa ja neurologisia sairauksia voidaan tutkia in vitro -alustoilla, joissa keinotekoisesti kasvatettujen kehon kudoksia muistuttavien solurakenteiden toimintaa voidaan mitata ja kuvantaa. Hermotoiminnan mallintamiseen ja mittaamiseen sopivat erityisesti läpinäkyvät, silikonista valetut mikrofluidistiset laitteet, joissa eri solupopulaatiota yhdistävät mikrokanavia pitkin kasvavat aksonit.
Esimerkiksi aivokuoresta on löydetty alueita, joissa viestit kulkevat vain yhteen suuntaan yhdensuuntaisesti kasvaneita aksoneja pitkin. Mikrofluidistisen laitteen mikrokanavat voidaan erityisesti suunnitella estämään aksonien kasvua vastakkaisesta populaatiosta ja siten kasvattaa yhdensuuntaisia hermopiirejä laboratoriossa. Tarkoin valikoivan luonteensa vuoksi tällaisia kanavia kutsutaan aksonaalisiksi diodeiksi.
Diplomityön tavoitteena oli suunnitella, valmistaa ja karakterisoida aikaisemmin kehitettyyn mikrofluidistiseen laitteeseen uudenlaisia kolmiulotteisia (3D) diodeja, jotka yhdistävät kolme lineaarisesti paikoitettua solukammiota. Lisäksi työssä valmistettiin ”kaksiulotteisia” (2D) diodeja vertailukohdaksi solukokeisiin kolmelle erikokoiselle 3D-diodille ja eri diodityyppien valmistusprosesseja vertailtiin. Mikäli 3D diodeja voidaan valmistaa, niitä tulee testata soluilla jatkokehitystä varten.
Diodien valmistusprosessi on yhdistelmä kahden fotonin polymerisaatioon (2PP) perustuvaa 3D-tulostusta, optista ultraviolettivalo- (UV) litografiaa, stereolitografia- (SLA) 3D-tulostusta sekä silikonivalua. Valumuotti koostui piikiekolle valmistetuista diodeista, optisella litografialla valmistetuista solukammioista sekä SLA 3D-tulostetuista makroinserteistä, jotka valavat silikoniin avoimen pääsyn solukammioihin. 3D-diodit valmistettiin 2PP:ta hyödyntävällä 3D-tulostimella ja 2D-diodit optisella litografialla. Diodit karakterisoitiin pyyhkäisyelektronimikroskoopin, kontaktiprofilometrin, optisen profilometrin sekä fluoresenssikuvauksen avulla. Myös laitteiden valuprosessin tarkkuutta ja täsmällisyyttä arvioitiin.
2PP 3D-tulostetut diodit sopivat litografiaprosessointiin ja niillä voitiin valaa silikonisia 3D-diodilaitteita. Valettujen diodien xy-piirteille mitatut arvot viittasivat käytettyjen 2PP 3D-tulostusparametrien toimivan tarkemmin pienimpien piirteiden valmistuksessa verrattuna optisessa litografiassa käytettyihin parametreihin, mutta molemmat valmistusprosessit vaativat edelleen optimointia. 3D diodien z-piirteiden tarkempaan mittaamiseen tulee testata optista profilometriä hiilipinnoitetuille laitteille. Sekä 2D- että 3D-diodien piirteet tulee mitata myös muoteista valmistusparametrien optimoimiseksi.
Myös laitteiden valuprosessi vaatii kehitystä. Ongelmia tuottivat erityisesti mikrokuplat sekä laitteiden repeämät, joiden vuoksi muottien saannot olivat vain 17–43%. Kovettamattoman silikonin paineistus kolme kertaa -0.7 baariin sekä tasaaminen ilmanpaineessa saattavat ehkäistä kuplanmuodostusta. Repeytymistä voi ehkäistä muottien tuoreella fluorosilaanipinnoituksella ja poistamalla kovettunut silikoni hitaasti muotista.