Construction and characterization of a fluorescence measurement setup
Kokko, Elias (2021)
2021
Bioteknologian ja biolääketieteen tekniikan maisteriohjelma - Master's Programme in Biotechnology and Biomedical Engineering
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2021-05-11
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202104263649
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202104263649
Tiivistelmä
The aim of this thesis was to construct and characterize a fluorescence measurement setup that would serve as a basis for the development of a subsystem that could eventually be integrated to an existing in vitro illumination device. This added functionality would grant the illumination device the means to measure fluorescence intensity from in vitro samples while maintaining the capability to illuminate the samples.
The work began by outlining the design of the layout of the optical system, which followed the principle of the Ploem system to an extent. This type of system is frequently used in for example fluorescence microscopy and typically contains a light source for fluorescence excitation, a sample containing substance that can emit fluorescence and an optical detector that can sense the fluorescent light such as a photomultiplier. Furthermore, the system contains optical elements such as optical filters and lenses that allow the fluorescent properties of the sample to be studied without encumbering the detector-side with the excitation light.
The targets for the design were to illuminate the sample with laser light at 488 nm wavelength and to measure the intensity of the emitted fluorescence occurring at the wavelength of 515 nm. The optical setup constructed in this thesis would function as a proof-of-concept for integrating a fluorescence measurement subsystem to an in vitro illumination device. Hence, design guidelines such as compatibility with common sample holders and modularity were taken into account during the design and construction of the measurement setup.
After the necessary components had been selected and their arrangement decided, the components were assembled together to form the optical assembly. The entire measurement setup consisted of smaller subassemblies, which were the excitation source, collimation assembly, dichroic filter assembly, excitation light focusing and fluorescence collection assembly and finally the detector assembly. The collimation assembly and the emission filter within the detector assembly were characterized to study their performance and compare their properties.
Finally, the functionality of the constructed setup was evaluated by performing actual fluorescence measurements. The system did function as intended, being able to detect fluorescence taking place at 515 nm wavelength when the samples were excited with 488 nm wavelength laser light.
On the other hand, the setup was rather prone to noise artifacts resulting from various sources such as mechanical vibration and the excitation light reaching the detector. Thus, the constructed setup did not offer as stable performance as desired. This leaves room for improvement in future development, where the entire setup would also need to be scaled down in its physical size to allow its integration as a subsystem. In addition, the performance of the fluorescence detection could be improved by optimizing the optical layout. Tämän työn tavoitteena oli rakentaa ja karakterisoida fluoresenssimittausjärjestely, joka tulisi toimimaan perustana eräälle in vitro valotuslaitteeseen integroitavalle alijärjestelmälle. Kyseinen lisätoiminnallisuus mahdollistaisi fluoresenssi-intensiteettimittaukset in vitro –näytteistä samalla ylläpitäen jo olemassa olevan laitteen kyvyn valottaa näytteitä.
Työ alkoi mittausjärjestelyn optisen puolen suunnittelusta, joka pohjautui niin kutsuttuun Ploemin järjestelmään. Tämän kaltainen järjestely on yleisesti käytetty fluoresenssimikroskoopeissa ja sisältää yleensä valonlähteen, jolla näytteitä voidaan virittää, jotta ne saisivat aikaan fluoresenssia. Tämän lisäksi järjestelyyn kuuluu näyte, joka sisältää fluoresoivaa ainetta, sekä optinen anturi kuten valomonistin, jolla näytteestä emittoituvaa fluoresenssia voidaan havaita. Muita tyypillisiä järjestelmään kuuluvia osia ovat esimerkiksi optiset suodattimet ja linssit, joilla näytteen ominaisuuksia voidaan tutkia fluoresenssin avulla ilman, että anturipuoli saturoituu näytteen viritykseen käytetystä valosta.
Tavoitteet mittausjärjestelylle tässä työssä oli asetettu niin, että sillä voitaisiin virittää näytteitä käyttäen 488 nm aallonpituudella olevaa laservaloa ja mitata näytteestä emittoituvaa fluoresenssia 515 nm aallonpituudella. Ajatuksena oli, että tässä työssä rakennettu mittausjärjestely voisi toimia lähtökohtana alijärjestelmälle, joka aikanaan tultaisiin asentamaan osaksi in vitro –näytteiden valotuslaitetta. Tästä johtuen suunnittelussa otettiin huomioon muun muassa yhteensopivuus yleisten näyteastioiden kanssa sekä modulaarisuus, joka mahdollistaisi järjestelyn muokkaamisen sovelluskohteesta riippuen.
Komponenttien valitsemisen ja niiden keskinäisen sijoittelun suunnittelemisen jälkeen mittausjärjestely voitiin rakentaa. Koko järjestely koostui pienemmistä kokonaisuuksista, joita olivat viritysvalon lähde (laserlaite), valon kollimointi, ohutkalvosuodatin ja sen pidin, viritysvalon ja fluoresenssin keräyksestä vastaava kokonaisuus sekä optisen anturin sisältävä osa. Valon kollimoinnista vastaava osuus ja optisen anturin yhteydessä oleva emissiosuodatin karakterisoitiin mittausjärjestelyn suorituskyvyn ymmärtämiseksi ja eri komponenttivaihtoehtojen vertailemiseksi.
Mittausjärjestelyn suorituskykyä arvioitiin suorittamalla fluoresenssimittauksia fluoresoiville näytteille. Järjestelmä toimi suunnitellusti ja kykeni mittaamaan 515 nm aallonpituudella olevaa fluoresenssia, kun näytteitä viritettiin laservalolla 488 nm aallonpituudella.
Järjestely oli kuitenkin lopulta melko altis häiriöille, jotka aiheutuvat erilaisista lähteistä kuten mittausjärjestelyyn kohdistuvasta mekaanisesta tärinästä ja näytteen virityksessä käytetyn valon liiallisesta vuotamisesta anturille, minkä johdosta järjestelyn toiminta ei ollut niin vakaata kuin toivottiin. Näitä heikkouksia voidaan pyrkiä kehittämään tulevaisuudessa, kun järjestelyä lähdetään muokkaamaan alijärjestelmäksi. Tällöin suunnittelussa tulee ottaa myös huomioon järjestelyn toteuttaminen pienemmässä koossa ja mahdollisesti optisen puolen optimointi havaitsemispuolen suorituskyvyn parantamiseksi.
The work began by outlining the design of the layout of the optical system, which followed the principle of the Ploem system to an extent. This type of system is frequently used in for example fluorescence microscopy and typically contains a light source for fluorescence excitation, a sample containing substance that can emit fluorescence and an optical detector that can sense the fluorescent light such as a photomultiplier. Furthermore, the system contains optical elements such as optical filters and lenses that allow the fluorescent properties of the sample to be studied without encumbering the detector-side with the excitation light.
The targets for the design were to illuminate the sample with laser light at 488 nm wavelength and to measure the intensity of the emitted fluorescence occurring at the wavelength of 515 nm. The optical setup constructed in this thesis would function as a proof-of-concept for integrating a fluorescence measurement subsystem to an in vitro illumination device. Hence, design guidelines such as compatibility with common sample holders and modularity were taken into account during the design and construction of the measurement setup.
After the necessary components had been selected and their arrangement decided, the components were assembled together to form the optical assembly. The entire measurement setup consisted of smaller subassemblies, which were the excitation source, collimation assembly, dichroic filter assembly, excitation light focusing and fluorescence collection assembly and finally the detector assembly. The collimation assembly and the emission filter within the detector assembly were characterized to study their performance and compare their properties.
Finally, the functionality of the constructed setup was evaluated by performing actual fluorescence measurements. The system did function as intended, being able to detect fluorescence taking place at 515 nm wavelength when the samples were excited with 488 nm wavelength laser light.
On the other hand, the setup was rather prone to noise artifacts resulting from various sources such as mechanical vibration and the excitation light reaching the detector. Thus, the constructed setup did not offer as stable performance as desired. This leaves room for improvement in future development, where the entire setup would also need to be scaled down in its physical size to allow its integration as a subsystem. In addition, the performance of the fluorescence detection could be improved by optimizing the optical layout.
Työ alkoi mittausjärjestelyn optisen puolen suunnittelusta, joka pohjautui niin kutsuttuun Ploemin järjestelmään. Tämän kaltainen järjestely on yleisesti käytetty fluoresenssimikroskoopeissa ja sisältää yleensä valonlähteen, jolla näytteitä voidaan virittää, jotta ne saisivat aikaan fluoresenssia. Tämän lisäksi järjestelyyn kuuluu näyte, joka sisältää fluoresoivaa ainetta, sekä optinen anturi kuten valomonistin, jolla näytteestä emittoituvaa fluoresenssia voidaan havaita. Muita tyypillisiä järjestelmään kuuluvia osia ovat esimerkiksi optiset suodattimet ja linssit, joilla näytteen ominaisuuksia voidaan tutkia fluoresenssin avulla ilman, että anturipuoli saturoituu näytteen viritykseen käytetystä valosta.
Tavoitteet mittausjärjestelylle tässä työssä oli asetettu niin, että sillä voitaisiin virittää näytteitä käyttäen 488 nm aallonpituudella olevaa laservaloa ja mitata näytteestä emittoituvaa fluoresenssia 515 nm aallonpituudella. Ajatuksena oli, että tässä työssä rakennettu mittausjärjestely voisi toimia lähtökohtana alijärjestelmälle, joka aikanaan tultaisiin asentamaan osaksi in vitro –näytteiden valotuslaitetta. Tästä johtuen suunnittelussa otettiin huomioon muun muassa yhteensopivuus yleisten näyteastioiden kanssa sekä modulaarisuus, joka mahdollistaisi järjestelyn muokkaamisen sovelluskohteesta riippuen.
Komponenttien valitsemisen ja niiden keskinäisen sijoittelun suunnittelemisen jälkeen mittausjärjestely voitiin rakentaa. Koko järjestely koostui pienemmistä kokonaisuuksista, joita olivat viritysvalon lähde (laserlaite), valon kollimointi, ohutkalvosuodatin ja sen pidin, viritysvalon ja fluoresenssin keräyksestä vastaava kokonaisuus sekä optisen anturin sisältävä osa. Valon kollimoinnista vastaava osuus ja optisen anturin yhteydessä oleva emissiosuodatin karakterisoitiin mittausjärjestelyn suorituskyvyn ymmärtämiseksi ja eri komponenttivaihtoehtojen vertailemiseksi.
Mittausjärjestelyn suorituskykyä arvioitiin suorittamalla fluoresenssimittauksia fluoresoiville näytteille. Järjestelmä toimi suunnitellusti ja kykeni mittaamaan 515 nm aallonpituudella olevaa fluoresenssia, kun näytteitä viritettiin laservalolla 488 nm aallonpituudella.
Järjestely oli kuitenkin lopulta melko altis häiriöille, jotka aiheutuvat erilaisista lähteistä kuten mittausjärjestelyyn kohdistuvasta mekaanisesta tärinästä ja näytteen virityksessä käytetyn valon liiallisesta vuotamisesta anturille, minkä johdosta järjestelyn toiminta ei ollut niin vakaata kuin toivottiin. Näitä heikkouksia voidaan pyrkiä kehittämään tulevaisuudessa, kun järjestelyä lähdetään muokkaamaan alijärjestelmäksi. Tällöin suunnittelussa tulee ottaa myös huomioon järjestelyn toteuttaminen pienemmässä koossa ja mahdollisesti optisen puolen optimointi havaitsemispuolen suorituskyvyn parantamiseksi.