Optimizing hydrogels for neuro-vascular co-culture studies in microfluidic devices

Abstract

Neuronal and vascular networks cover the whole human body and are essential for the normal functions of tissues. Nervous systems rely on electrochemical signals to transfer information and control the homeostasis of human body, while the vascular network provides oxygen and nutrients for the cells in all tissues. Since these two network systems are crucial for the normal functions of tissues, it is important to understand their roles and interactions in tissue development, maintenance of homeostasis and in different pathological conditions. Thus, neuro-vascular in vitro models are needed for obtaining a better understanding about the relationship between these two networks.

Because the two-dimensional (2D) models are not good at mimicking the actual environment the cells have in vivo, three-dimensional (3D) models are needed for more realistic tissue models. Hydrogels are commonly used for 3D cell cultures. Those are three-dimensional networks that have a major water absorption capacity. In this thesis, hydrogels and cell culture media were optimized for human induced pluripotent stem cell (hiPSC) -derived neural progenitor cells. The aim was to see how different cell culture media affect hydrogels and neuronal cell growth. This information can later be applied to neuro-vascular co-culture studies.

In the study, culturing hiPSC-derived neural progenitor cells was tested in 1) collagen I hydrogel, 2) fibrin hydrogel and 3) collagen I–fibrin hydrogel. The cells were seeded inside the three different hydrogels in 24-well-plate format. In collagen I and collagen I–fibrin hydrogels cells were seeded also in commercial AIM Biotech 3D Cell Culture Chips. For the cell cultures in AIM Biotech chips, endothelial cell growth medium-2 (EGM-2), neural maturation media (NMM) and 1:1 mixture medium of EGM-2 and NMM were tested. The cell cultures were maintained for up to 14 days. The growth of the cells and the appearance of the hydrogel were being observed during the culturing period.

The results showed that collagen I hydrogel stayed intact in both 24-well-plate and AIM Biotech chip in NMM for 14 days. However, used cell culture media affects collagen I hydrogel integrity and collagen I hydrogel shrunk in AIM Biotech chip in EGM-2 medium and 1:1 mixture medium. Fibrin hydrogel showed strong degradation in NMM in 24-well-plate and the experiments were not continued in AIM Biotech chips. Collagen I–fibrin hydrogel showed degradation and shrinkage during the culturing period in NMM in 24-well-plate. The shrinkage was major in AIM Biotech chip cultures and it was observed in cultures in all three media. In addition to affecting hydrogel integrity, used cell culture media affected also neuronal cell growth. In NMM, the growth of the cells was typical for neuronal cells. EGM-2 medium changed the growth of the cells. In 1:1 mixture medium there was also some cells that expressed untypical growth.

The information gained from hydrogel optimization performed in this study serves as a basis for finding optimal hydrogel for 3D neuro-vascular co-cultures in microfluidic cell culture device. More studies need to be performed with collagen I hydrogel and collagen I–fibrin hydrogel to find an optimal hydrogel for neuro-vascular co-cultures.

Hermo- ja verisuoniverkostot kattavat koko ihmiskehon ja ovat välttämättömiä kudosten normaalille toiminnalle. Hermosolujen välinen viestintä solulta toiselle perustuu sähkökemiallisiin signaaleihin. Näiden signaaleiden avulla solut välittävät informaatiota ja ylläpitävät homeostasiaa ihmiskehossa. Verisuonet taas tarjoavat happea ja ravinteita soluille kaikissa elimistön kudoksissa, jonka lisäksi ne osallistuvat immuunipuolustukseen ja kudosten korjausprosesseihin. Koska nämä kaksi verkostoa ovat välttämättömiä elimistön normaalille toiminnalle, on tärkeää ymmärtää niiden keskinäiset roolit ja vuorovaikutukset kudosten kehityksessä, homeostasian ylläpidossa sekä erilaisissa patologisissa tiloissa. Neuro-vaskulaari in vitro -malleja tarvitaan näiden vuorovaikutusten tutkimiseen ja ymmärtämiseen.

2D-kudosmallit eivät jäljittele hyvin solujen todellista in vivo -ympäristöä, minkä vuoksi tarvitaan 3D-malleja realistisempien kudosmallien luomiseksi. Hydrogeelit ovat materiaaleja, joita käytetään yleisesti 3D-soluviljelmissä. Ne ovat kolmiulotteisia verkkoja, jotka pystyvät sitomaan itseensä suuren määrän vettä. Tässä tutkielmassa hydrogeelejä ja soluviljely mediumeja optimoitiin ihmisen indusoiduista pluripotenteista kantasoluista (human induced pluripotent stem cell, hiPSC) erilaistetuille hermosolujen kantasoluille mikrofluidistisissa kudossiruissa. Tutkielman tarkoituksena oli selvittää, kuinka hydrogeelit ja solut reagoivat erilaisiin soluviljely mediumeihin. Tutkielmasta saatavaa informaatiota voidaan myöhemmin hyödyntää neuro–vaskulaari-yhteisviljelmätutkimuksiin.

Tutkimuksessa hiPSC-erilaistettujen hermosolujen kantasolujen viljelyä testattiin erilaisissa hydrogeeleissä. Käytetyt hydrogeelit olivat 1) kollageeni I -hydrogeeli, 2) fibriinihydrogeeli ja 3) kollageeni I–fibriini -hydrogeeli. Solujen viljelyä testattiin kaikissa kolmessa hydrogeelissä 24-kuoppalevyllä. Kollageeni I -ja kollageeni 1–fibriini -hydrogeeleissä solujen viljelyä testattiin myös kaupallisessa AIM Biotech:n 3D-kudossirussa. AIM Biotech:n kudossiruissa oleville näytteille testattiin myös kolmea eri soluviljely mediumia, jotka olivat 1) endoteelisolujen kasvumedium (EGM-2), 2) neuraalinen maturaatio medium (NMM) ja 3) 1:1 sekoitusmedium, joka koostui EGM-2 -mediumista ja NMM-mediumista. Soluviljelmiä ylläpidettiin tutkimuksessa korkeintaan 14 päivän ajan. Tämän ajanjakson aikana solujen kasvua ja hydrogeelien ulkonäköä tarkasteltiin.

Tutkimuksessa osoitettiin, että kollageeni I -hydrogeeli pysyy ehjänä sekä 24-kuoppalevyllä että AIM Biotech:n kudossiruissa NMM-mediumissa 14 päivän ajan. Käytetyt soluviljely mediumit vaikuttivat kuitenkin kollageeni I -hydrogeelin eheyteen, sillä EGM-2 –mediumissa ja 1:1 sekoitusmediumissa hydrogeeleissä oli havaittavissa kutistumista AIM Biotech:n kudossiruissa. Fibriinihydrogeelit hajosivat nopeasti NMM-mediumissa 24-kuoppalevyillä, minkä vuoksi tutkimuksia ei jatkettu AIM Biotech:n kudossiruissa. Kutistumista havaittiin kollageeni I–fibriini -hydrogeelissä 24-kuoppalevyillä NMM-mediumissa sekä AIM Biotech:n kudossiruissa. AIM Biotech:n kudossiruissa hydrogeelin kutistuminen oli voimakkaampaa kuin 24-kuoppalevyllä, ja sitä havaittiin kaikissa kolmessa testatussa soluviljely mediumissa. Käytetty soluviljely medium vaikutti hydrogeelien eheyden lisäksi solujen kasvuun. NMM-mediumissa solujen kasvu oli tyypillistä hermosoluille. EGM-2 -medium muutti solujen kasvua epätyypilliseksi hermosoluille. Myös 1:1 sekoitusmediumissa oli havaittavissa jonkin verran epätyypillisesti kasvavia soluja.

Tutkimuksesta saatua informaatiota hydrogeelien optimoinnista hiPSC-erilaistetuille hermosolujen kantasoluille voidaan käyttää pohjana optimaalisen hydrogeelin löytämiselle 3D-neuro–vaskulaari-yhteisviljelmille mikrofluidistisissa kudossiruissa. Optimaalisen yhteisviljelmiin soveltuvan hydrogeelin löytämiseksi on suoritettava lisää tutkimuksia erityisesti kollageeni I -ja kollageeni I–fibriini -hydrogeeleillä.