Evaluation of Detectable Layer Thickness in Biosensors
Åman, Tommi (2021)
Åman, Tommi
2021
Bioteknologian ja biolääketieteen tekniikan maisteriohjelma - Master's Programme in Biotechnology and Biomedical Engineering
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. Only for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2021-04-29
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202104243431
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202104243431
Tiivistelmä
Biomensio Mass Sensitive Micro Array (MSMA) biosensor is a miniaturised acoustic biosensor with 64 individually sensing pixels. MSMA is a label-free detection technology suitable for on-site measurements and was lately demonstrated suitable for e.g., mycotoxin detection from grains. While miniaturisation comes with many great benefits including possibilities for cost reduction and multiple analyte detection, there are also some limitations. According to previous literature, a miniaturised, high frequency acoustic resonator-based biosensor has a limited penetration depth, i.e., the maximum layer thickness with which it can still detect the biological binding events on the surface. In this thesis, the maximum detection depth is of the MSMA sensor was compared to commercially available and well-documented Quartz Crystal Microbalance (QCM) and Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors.
The comparison was done using a biological model assay in which layers of biotinylated Bovine Serum Albumin (b-BSA) and neutralised Chimeric Avidin (nChiAvd) were deposited on the biosensor surfaces in a layer-by-layer manner. As a first step, Bovine Serum Albumin was biotinylated and biotinylation ratio was determined using a colourimetric 4’-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid – avidin assay.
Initially, 30 cycles of alternating nChiAvd and b-BSA injections were measured with MSMA, QCM and SPR. As the measurement data indicated that the linear detectable range of QCM and SPR was greater than reached with the 30 injection cycles, a longer measurement with 50 cycles was performed on both the SPR and QCM sensors. It was observed that the longer measurements yielded in a sensorgram with non-linear behaviour when the biological layer grows thick enough. The MSMA response for the 30 cycles yielded in a linear range of 12 cycles after which a phenomenon called film resonance was observed with the overall response beginning to reduce with each injection cycle.
It was observed in this study that the penetration depth of the MSMA sensor is more limited than that of SPR and QCM. However, based on the data, the MSMA still has a detectable range of roughly 120 nm from the resonator surface, as each cycle yields in a layer of roughly 10 nm based on the literature. The detectable layer thickness of 120 nm should be enough for most assays detecting small molecules as well as proteins and nucleic acids. Even larger particles of diameters of 100 nm and above are partly in the detectable range. On the other hand, it must be noted that the penetration depth of acoustic biosensors is related not only to the resonance frequency of the resonator but also to the visco-elastic characteristics of the bound layer. Due to this, the results are indicative for similar protein layers and the results may differ with layers with different characteristics.
The layer-by-layer deposition assay developed in this thesis project can act as a benchmark assay for future generations of the Biomensio MSMA sensor chip. The comparison is also scientifically relevant as previous literature in the field focuses on comparison between QCM and SPR, QCM and MSMA, or SPR and MSMA but not between all three technologies. Biomension massaherkkä mikromatriisianturi (engl. Mass Sensitive Micro Array, MSMA) on miniatyrisoitu akustinen bioanturi, jossa on 64 itsenäisesti aistivaa pikseliä. MSMA-anturi on leimaton detektioteknologia, joka mahdollistaa nopean kentällä tapahtuvan analyysin ja jota on käytetty onnistuneesti muun muassa mykotoksiinien detektointiin viljoista. Miniatyrisointi tuo lukuisia merkittäviä etuja verrattuna perinteisiin bioanturitekniikoihin, mukaan lukien halvemman hinnan ja mahdollisuuden useamman analyytin samanaikaiseen havaitsemiseen. Alan aiemmasta kirjallisuudesta voidaan havaita, että miniatyrisoidulla, korkeataajuiseen akustiseen resonaattoriin perustuvalla bioanturilla on rajallinen penetraatiosyvyys eli suurin kerrospaksuus, jossa se kykenee edelleen havaitsemaan biologisia sitoutumistapahtumia. Tässä tutkielmassa MSMA bioanturin suurinta havaittavaa kerrospaksuutta verrattiin kaupallisesti saatavilla oleviin, hyvin dokumentoituihin biosensoreihin, kvartsikidemikrovaakaan (engl. Quartz Crystal Microbalance, QCM) ja pintaplasmoniresonanssianturiin (engl. Surface Plasmon Resonance, SPR).
Vertailu tehtiin biologisella mallimittauksella, jossa biotinyloitua naudan seerumin albumiiniproteiinia (engl. Biotinylated Bovine Serum Albumin, b-BSA) ja neutraalia kimeeristä avidiinia (engl. Neutralised Chimeric Avidin, nChiAvd) kiinnitettiin bioanturien pintaan kerroksittain. Ennen varsinaisia mittauksia naudan seerumin albumiini biotinyloitiin ja reaktiotuotteen biotinylointiaste määritettiin käyttämällä kolorimetristä 4’-hydroksiazobentseeni-2-karboksyylihappo-avidiinimääritystä.
Aluksi mitattiin 30 sykliä vuorottelevia nChiAvd- ja b-BSA-injektioita MSMA-, QCM- ja SPR-antureilla. Nämä yhteensä 60 näyteinjektion mittaukset näyttivät, että QCM:n ja SPR:n lineaarinen mitattava kerrospaksuus on paksumpi kuin 30 nChiAvd-b-BSA-sykliä tuottivat. Havainnon jälkeen QCM:llä ja SPR:llä mitattiin vielä 50 sykliä kestänyt pidempi mittaus. Pidemmän mittauksen mittauskäyrä näyttää epälineaarista käytöstä, kun biokerros anturin pinnalla kasvoi riittävän paksuksi. MSMA:lla 30 sykliä kestäneessä mittauksessa vaste kasvoi lineaarisesti ensimmäiset 12 mittaussykliä, minkä jälkeen vaste kääntyi ja alkoi pienentyä, kunnes tasaantui. Ilmiö tunnetaan aiemmassa kirjallisuudessa nimellä filmiresonanssi.
Kerätyn datan perusteella MSMA-anturin penetraatiosyvyys on rajallinen verrattuna SPR:n ja QCM:n. Kuitenkin datan mukaan MSMA:lla mitattava kerrospaksuus on noin 120 nm resonaattorin pinnasta, kun kirjallisuuden perusteella arvioidaan yhden syklin tuottaman kerroksen paksuudeksi noin 10 nm. 120 nm havaittava kerrospaksuus kuitenkin mahdollistaa useimmat pienmolekyylejä, proteiineja ja nukleiinihappoja havaitsevat määrityskerrokset. Jopa suuremmat, halkaisijaltaan yli 100 nm partikkelit ovat oletettavasti ainakin osittain havaittavan alueen sisällä. On kuitenkin tärkeä huomata, että akustisten anturien penetraatiosyvyys on riippuvainen paitsi anturin resonanssitaajuudesta myös sitoutuneen kerroksen visko-elastisista ominaisuuksista. Tästä johtuen tämän tutkimuksen tulokset kuvaavat suoraan vain tilannetta, jossa havaittava kerros muodostuu proteiineita, ja visko-elastisilta ominaisuuksiltaan erilaisille biokerroksille saatavat mittaustulokset voivat poiketa tässä tutkimuksessa havaituista.
Tässä tutkielmaprojektissa kehitetty kerroksittainen paksuusmääritys voi toimia jatkossa lähtötasona ja vertailukohtana, kun vastaavanlaisia pietsoresonaattoreita vertaillaan. Tieteenalan näkökulmasta tutkimus on myös mielenkiintoinen, sillä, kuten tutkielman kirjallisuuskatsausta tehdessä kävi ilmi, tieteenalan aiemmassa kirjallisuudessa on vertailtu keskenään SPR:ää ja QCM:ää, SPR:ää ja MSMA:ta tai QCM:ää ja MSMA:ta, muttei samassa tutkimuksessa kaikkia kolmella samalla mallimittauksella.
The comparison was done using a biological model assay in which layers of biotinylated Bovine Serum Albumin (b-BSA) and neutralised Chimeric Avidin (nChiAvd) were deposited on the biosensor surfaces in a layer-by-layer manner. As a first step, Bovine Serum Albumin was biotinylated and biotinylation ratio was determined using a colourimetric 4’-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid – avidin assay.
Initially, 30 cycles of alternating nChiAvd and b-BSA injections were measured with MSMA, QCM and SPR. As the measurement data indicated that the linear detectable range of QCM and SPR was greater than reached with the 30 injection cycles, a longer measurement with 50 cycles was performed on both the SPR and QCM sensors. It was observed that the longer measurements yielded in a sensorgram with non-linear behaviour when the biological layer grows thick enough. The MSMA response for the 30 cycles yielded in a linear range of 12 cycles after which a phenomenon called film resonance was observed with the overall response beginning to reduce with each injection cycle.
It was observed in this study that the penetration depth of the MSMA sensor is more limited than that of SPR and QCM. However, based on the data, the MSMA still has a detectable range of roughly 120 nm from the resonator surface, as each cycle yields in a layer of roughly 10 nm based on the literature. The detectable layer thickness of 120 nm should be enough for most assays detecting small molecules as well as proteins and nucleic acids. Even larger particles of diameters of 100 nm and above are partly in the detectable range. On the other hand, it must be noted that the penetration depth of acoustic biosensors is related not only to the resonance frequency of the resonator but also to the visco-elastic characteristics of the bound layer. Due to this, the results are indicative for similar protein layers and the results may differ with layers with different characteristics.
The layer-by-layer deposition assay developed in this thesis project can act as a benchmark assay for future generations of the Biomensio MSMA sensor chip. The comparison is also scientifically relevant as previous literature in the field focuses on comparison between QCM and SPR, QCM and MSMA, or SPR and MSMA but not between all three technologies.
Vertailu tehtiin biologisella mallimittauksella, jossa biotinyloitua naudan seerumin albumiiniproteiinia (engl. Biotinylated Bovine Serum Albumin, b-BSA) ja neutraalia kimeeristä avidiinia (engl. Neutralised Chimeric Avidin, nChiAvd) kiinnitettiin bioanturien pintaan kerroksittain. Ennen varsinaisia mittauksia naudan seerumin albumiini biotinyloitiin ja reaktiotuotteen biotinylointiaste määritettiin käyttämällä kolorimetristä 4’-hydroksiazobentseeni-2-karboksyylihappo-avidiinimääritystä.
Aluksi mitattiin 30 sykliä vuorottelevia nChiAvd- ja b-BSA-injektioita MSMA-, QCM- ja SPR-antureilla. Nämä yhteensä 60 näyteinjektion mittaukset näyttivät, että QCM:n ja SPR:n lineaarinen mitattava kerrospaksuus on paksumpi kuin 30 nChiAvd-b-BSA-sykliä tuottivat. Havainnon jälkeen QCM:llä ja SPR:llä mitattiin vielä 50 sykliä kestänyt pidempi mittaus. Pidemmän mittauksen mittauskäyrä näyttää epälineaarista käytöstä, kun biokerros anturin pinnalla kasvoi riittävän paksuksi. MSMA:lla 30 sykliä kestäneessä mittauksessa vaste kasvoi lineaarisesti ensimmäiset 12 mittaussykliä, minkä jälkeen vaste kääntyi ja alkoi pienentyä, kunnes tasaantui. Ilmiö tunnetaan aiemmassa kirjallisuudessa nimellä filmiresonanssi.
Kerätyn datan perusteella MSMA-anturin penetraatiosyvyys on rajallinen verrattuna SPR:n ja QCM:n. Kuitenkin datan mukaan MSMA:lla mitattava kerrospaksuus on noin 120 nm resonaattorin pinnasta, kun kirjallisuuden perusteella arvioidaan yhden syklin tuottaman kerroksen paksuudeksi noin 10 nm. 120 nm havaittava kerrospaksuus kuitenkin mahdollistaa useimmat pienmolekyylejä, proteiineja ja nukleiinihappoja havaitsevat määrityskerrokset. Jopa suuremmat, halkaisijaltaan yli 100 nm partikkelit ovat oletettavasti ainakin osittain havaittavan alueen sisällä. On kuitenkin tärkeä huomata, että akustisten anturien penetraatiosyvyys on riippuvainen paitsi anturin resonanssitaajuudesta myös sitoutuneen kerroksen visko-elastisista ominaisuuksista. Tästä johtuen tämän tutkimuksen tulokset kuvaavat suoraan vain tilannetta, jossa havaittava kerros muodostuu proteiineita, ja visko-elastisilta ominaisuuksiltaan erilaisille biokerroksille saatavat mittaustulokset voivat poiketa tässä tutkimuksessa havaituista.
Tässä tutkielmaprojektissa kehitetty kerroksittainen paksuusmääritys voi toimia jatkossa lähtötasona ja vertailukohtana, kun vastaavanlaisia pietsoresonaattoreita vertaillaan. Tieteenalan näkökulmasta tutkimus on myös mielenkiintoinen, sillä, kuten tutkielman kirjallisuuskatsausta tehdessä kävi ilmi, tieteenalan aiemmassa kirjallisuudessa on vertailtu keskenään SPR:ää ja QCM:ää, SPR:ää ja MSMA:ta tai QCM:ää ja MSMA:ta, muttei samassa tutkimuksessa kaikkia kolmella samalla mallimittauksella.