Optimization of calcium imaging for human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in cell culture conditions
Keränen, Jenni (2021)
Keränen, Jenni
2021
Bioteknologian ja biolääketieteen tekniikan kandidaattiohjelma - Bachelor's Programme in Biotechnology and Biomedical Engineering
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2021-04-29
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202104233350
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202104233350
Tiivistelmä
Retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye between the outer segments of the photoreceptors and the choriocapillaris. RPE is vital for the survival of the photoreceptors and the whole optical system due to its role in, for example, nutrient transport, photo-oxidative stress reduction and ion homeostasis upkeep.
Calcium ions (Ca2+) are one of the most significant signalling molecules present in animal cells. Important cellular processes such as cell division and cell death are controlled through complex Ca2+ signalling pathways. In RPE, Ca2+ is stored mainly in the endoplasmic reticulum and highly pigmented melanosomes, from where the ions can be released through voltage-gated ion chan-nels or ligand-gated ion channels, for example.
In living cells, free cytosolic Ca2+ can be optically measured with a technique called Ca2+ im-aging. In this thesis, Ca2+ imaging was conducted with a chemical fluorescence indicator Fluo-4 together combined with fluorescence microscopy. When Fluo-4 binds freed Ca2+ in the cytosol, a change in the fluorescence intensity of Fluo-4 occurs. This change can be detected and recorded with a fluorescence microscope, and thus the Ca2+ signalling of living cells can be studied.
Ca2+ imaging experiments are often conducted at RT, even though the optimal temperature for living cells is +37°C. Imaging cells closer to their physiological conditions could yield better results compared to imaging performed at RT. Therefore, this thesis aimed to optimize Ca2+ imaging for RPE in cell culture conditions. The cells used for this study were human embryonic stem cell-derived (hESC-derived) RPE cells differentiated from the Regea08/023 cell line. RPE cells differ-entiated from the Regea08/017 cell line were used as a cell control. Two different Ca2+ imaging solutions, Elliot salt solution and Hibernate™ -A cell nutrient medium, were chosen to be tested for Ca2+ imaging performed at RT and +37°C.
In addition to Ca2+ imaging, immunofluorescence staining was performed for confocal imaging to show the presence of CaV1.3 voltage-gated Ca2+ channels in the hESC-RPE cells. In addition to CaV1.3, the cells were stained for a tight-junction-binding protein ZO-1. Intracellular actin was stained with the actin-binding toxin phalloidin.
The planned Ca2+ imaging experiments could not be conducted due to possibly too old 08/023 cells and expired Fluo-4 stock. After the first imaging sessions with Elliot solution and Hibernate -medium at RT, no Ca2+ imaging data could be recorded from any of the samples. Hibernate -medium was deemed not suitable for Ca2+ imaging performed with fluorescence microscopy due to a high amount of disturbing background during imaging. To truly assess how Ca2+ imaging per-formed at +37°C instead of RT affects the results, the experiments should be repeated with younger cells and a new Fluo-4 stock. Verkkokalvon pigmenttiepiteeli (engl. retinal pigment epithelium, RPE) on kuusikulmaisista so-luista koostuva yksinkertainen epiteelisolukerros, joka sijaitsee silmän takaosassa näköaistisolujen ulkojäsenten ja suonikalvon välissä. RPE on elintärkeä näköaistisolujen ja siten koko optisen jär-jestelmän selviytymiselle, koska sillä on tärkeä rooli esimerkiksi verkkokalvon ravinteiden kulje-tuksessa, foto-oksidatiivisen stressin vähentämisessä ja verkkokalvon ionitasapainon ylläpidossa.
Kalsiumionit (Ca2+) ovat yksi merkittävimmistä signalointimolekyyleistä, joita esiintyy eläinso-luissa. Monia tärkeitä soluprosesseja, kuten solunjakautumista ja solukuolemaa, ohjataan moni-mutkaisten Ca2+-signalointireittien välityksellä. RPE:ssä Ca2+ varastoidaan pääasiassa endoplas-makalvostoon ja voimakkaasti pigmentoituneihin melanosomeihin, joista ionit voidaan vapauttaa esimerkiksi jännite- tai ligandiriippuvaisten ionikanavien avulla.
Elävissä soluissa vapaata sytosolista Ca2+ voidaan mitata optisesti Ca2+-kuvantamiseksi kut-sutun tekniikan avulla. Tässä työssä Ca2+-kuvantaminen suoritettiin fluoresenssimikroskopialla ja kemiallisella Ca2+-indikaattorilla, Fluo-4:llä. Kun Fluo-4 sitoutuu sytosoliin vapautuneeseen Ca2+:iin, Fluo-4:n fluoresenssi-intensiteetissä tapahtuu muutos, joka voidaan havaita fluoresenssimikro-skoopilla.
Ca2+-kuvantamiskokeet toteutetaan usein huoneenlämmössä, vaikka elävien solujen optimaa-linen lämpötila on +37°C. Tämän tutkielman tarkoituksena oli optimoida Ca2+-kuvantamismenetelmää RPE:lle soluviljelyolosuhteissa, koska solujen kuvantaminen mahdolli-simman lähellä niiden fysiologisia olosuhteita voi johtaa parempiin tuloksiin verrattuna huoneen-lämmössä toteutettuun kuvantamiseen. Tässä tutkimuksessa käytetyt solut olivat ihmisen alkion kantasoluista peräisin olevia Regea08/023 solulinjasta erilaistettuja RPE-soluja. Regea08/017 lin-jan soluista erilaistettuja RPE-soluja käytettiin kontrollina. Optimointia varten valittiin kaksi erilaista Ca2+-kuvantamisliuosta testattavaksi huoneenlämpötilassa ja +37°C:ssa toteutetuille Ca2+-kuvantamisille: Elliot-suolaliuos ja Hibernate™-A-solujen kasvatusliuos.
Ca2+-kuvantamisen lisäksi suoritettiin immunovärjäys konfokaalikuvantamista varten CaV1.3-jännitekytkettyjen Ca2+-kanavien läsnäolon osoittamiseksi. CaV1.3:n lisäksi soluista värjättiin tiivis-liitoksiin sitoutuva proteiini ZO-1. Solutukirangan aktiini värjättiin aktiiniin sitoutuvalla myrkyllä, fal-loidiinilla.
Suunniteltuja Ca2+-kuvantamiskokeita ei voitu suorittaa mahdollisesti liian vanhojen 08/023 so-lulinjan solujen ja vanhentuneen Fluo-4:n vuoksi. Ensimmäisten Elliot ja Hibernate- huoneenläm-pökuvausten jälkeen Ca2+-kuvantamisdataa ei saatu mistään näytteessä. Hibernate-kasvatusliuos ei soveltunut fluoresenssimikroskoopilla toteutettuun Ca2+-kuvantamiseen, koska se aiheutti paljon häiritsevää taustafluoresenssia kuvantamisen aikana. Jotta voidaan todella arvioida, miten soluvil-jelyolosuhteissa toteutettu Ca2+- kuvantaminen vaikuttaa kuvantamistuloksiin, tulisi kokeet toistaa nuoremmilla soluilla sekä uudella Fluo-4-liuoksella.
Calcium ions (Ca2+) are one of the most significant signalling molecules present in animal cells. Important cellular processes such as cell division and cell death are controlled through complex Ca2+ signalling pathways. In RPE, Ca2+ is stored mainly in the endoplasmic reticulum and highly pigmented melanosomes, from where the ions can be released through voltage-gated ion chan-nels or ligand-gated ion channels, for example.
In living cells, free cytosolic Ca2+ can be optically measured with a technique called Ca2+ im-aging. In this thesis, Ca2+ imaging was conducted with a chemical fluorescence indicator Fluo-4 together combined with fluorescence microscopy. When Fluo-4 binds freed Ca2+ in the cytosol, a change in the fluorescence intensity of Fluo-4 occurs. This change can be detected and recorded with a fluorescence microscope, and thus the Ca2+ signalling of living cells can be studied.
Ca2+ imaging experiments are often conducted at RT, even though the optimal temperature for living cells is +37°C. Imaging cells closer to their physiological conditions could yield better results compared to imaging performed at RT. Therefore, this thesis aimed to optimize Ca2+ imaging for RPE in cell culture conditions. The cells used for this study were human embryonic stem cell-derived (hESC-derived) RPE cells differentiated from the Regea08/023 cell line. RPE cells differ-entiated from the Regea08/017 cell line were used as a cell control. Two different Ca2+ imaging solutions, Elliot salt solution and Hibernate™ -A cell nutrient medium, were chosen to be tested for Ca2+ imaging performed at RT and +37°C.
In addition to Ca2+ imaging, immunofluorescence staining was performed for confocal imaging to show the presence of CaV1.3 voltage-gated Ca2+ channels in the hESC-RPE cells. In addition to CaV1.3, the cells were stained for a tight-junction-binding protein ZO-1. Intracellular actin was stained with the actin-binding toxin phalloidin.
The planned Ca2+ imaging experiments could not be conducted due to possibly too old 08/023 cells and expired Fluo-4 stock. After the first imaging sessions with Elliot solution and Hibernate -medium at RT, no Ca2+ imaging data could be recorded from any of the samples. Hibernate -medium was deemed not suitable for Ca2+ imaging performed with fluorescence microscopy due to a high amount of disturbing background during imaging. To truly assess how Ca2+ imaging per-formed at +37°C instead of RT affects the results, the experiments should be repeated with younger cells and a new Fluo-4 stock.
Kalsiumionit (Ca2+) ovat yksi merkittävimmistä signalointimolekyyleistä, joita esiintyy eläinso-luissa. Monia tärkeitä soluprosesseja, kuten solunjakautumista ja solukuolemaa, ohjataan moni-mutkaisten Ca2+-signalointireittien välityksellä. RPE:ssä Ca2+ varastoidaan pääasiassa endoplas-makalvostoon ja voimakkaasti pigmentoituneihin melanosomeihin, joista ionit voidaan vapauttaa esimerkiksi jännite- tai ligandiriippuvaisten ionikanavien avulla.
Elävissä soluissa vapaata sytosolista Ca2+ voidaan mitata optisesti Ca2+-kuvantamiseksi kut-sutun tekniikan avulla. Tässä työssä Ca2+-kuvantaminen suoritettiin fluoresenssimikroskopialla ja kemiallisella Ca2+-indikaattorilla, Fluo-4:llä. Kun Fluo-4 sitoutuu sytosoliin vapautuneeseen Ca2+:iin, Fluo-4:n fluoresenssi-intensiteetissä tapahtuu muutos, joka voidaan havaita fluoresenssimikro-skoopilla.
Ca2+-kuvantamiskokeet toteutetaan usein huoneenlämmössä, vaikka elävien solujen optimaa-linen lämpötila on +37°C. Tämän tutkielman tarkoituksena oli optimoida Ca2+-kuvantamismenetelmää RPE:lle soluviljelyolosuhteissa, koska solujen kuvantaminen mahdolli-simman lähellä niiden fysiologisia olosuhteita voi johtaa parempiin tuloksiin verrattuna huoneen-lämmössä toteutettuun kuvantamiseen. Tässä tutkimuksessa käytetyt solut olivat ihmisen alkion kantasoluista peräisin olevia Regea08/023 solulinjasta erilaistettuja RPE-soluja. Regea08/017 lin-jan soluista erilaistettuja RPE-soluja käytettiin kontrollina. Optimointia varten valittiin kaksi erilaista Ca2+-kuvantamisliuosta testattavaksi huoneenlämpötilassa ja +37°C:ssa toteutetuille Ca2+-kuvantamisille: Elliot-suolaliuos ja Hibernate™-A-solujen kasvatusliuos.
Ca2+-kuvantamisen lisäksi suoritettiin immunovärjäys konfokaalikuvantamista varten CaV1.3-jännitekytkettyjen Ca2+-kanavien läsnäolon osoittamiseksi. CaV1.3:n lisäksi soluista värjättiin tiivis-liitoksiin sitoutuva proteiini ZO-1. Solutukirangan aktiini värjättiin aktiiniin sitoutuvalla myrkyllä, fal-loidiinilla.
Suunniteltuja Ca2+-kuvantamiskokeita ei voitu suorittaa mahdollisesti liian vanhojen 08/023 so-lulinjan solujen ja vanhentuneen Fluo-4:n vuoksi. Ensimmäisten Elliot ja Hibernate- huoneenläm-pökuvausten jälkeen Ca2+-kuvantamisdataa ei saatu mistään näytteessä. Hibernate-kasvatusliuos ei soveltunut fluoresenssimikroskoopilla toteutettuun Ca2+-kuvantamiseen, koska se aiheutti paljon häiritsevää taustafluoresenssia kuvantamisen aikana. Jotta voidaan todella arvioida, miten soluvil-jelyolosuhteissa toteutettu Ca2+- kuvantaminen vaikuttaa kuvantamistuloksiin, tulisi kokeet toistaa nuoremmilla soluilla sekä uudella Fluo-4-liuoksella.
Kokoelmat
- Kandidaatintutkielmat [8780]