Molecular and functional characterization of vldlr knockdown in zebrafish larvae

Abstract

Background and aims: Congenital neurodevelopmental disorders affect a multitude of people worldwide. Cerebellum is an essential part of the hindbrain that is malformed in many of these diseases. Cerebellar development includes differentiation and migration pathways of neural progenitor cells that are typically guided by a master regulator protein Reelin. Its signal is mediated to cells by receptors, encoded by genes such as very low-density lipoprotein receptor (vldlr). Downstream signalling results in cytoskeletal rearrangements and gene expression that prepares cells to undergo polarity changes and subsequent translocation to future cerebellar layers. Reelin signalling is compromised in humans lacking functional receptors, resulting in cerebellar hypoplasia and associated symptoms like intellectual disabilities and loss of movement control. Unravelling molecular details behind these pathways could result in improved treatment options. In addition, coherent disease modelling would be of value to the research of heterogenous neurodevelopmental disorders. Zebrafish is a small teleost species with mainly homologous cerebellar development to humans. Their cerebellum develops early during embryogenesis, making robust developmental model creation achievable. Thus, the purpose of this study is to characterize vldlr morphant population of zebrafish larvae and show the changes of gene expression at transcriptome level, revealing fascinating targets for future studies.

Materials and methods: Gene expression analysis and bioinformatics tools were used to estimate the level of evolutionary conservation as well as site-specific expression of vldlr variants. vldlr knockdown was performed by injecting translation blocking and splice-altering morpholinos into yolk of zebrafish embryos. Morphant phenotype was observed for five days and larvae were categorised based on the abundancy of developmental defects. Three sets of movement characterization were performed to evaluate damage in larval motor neurons. Hematoxylin and eosin staining and TUNEL assay were done to show morphological changes and apoptotic regions between morphant and control larvae. Whole-transcriptome sequencing was done to evaluate gene expression changes between morphant and control groups.

Results: VLDLR was found evolutionarily conserved between vertebrates. Transcript variants were located at several organs with predominant expression of type II gene at brain and ovaries. vldlr-morphant zebrafish embryos and larvae showed impaired head and eye development that was dependable on morpholino concentration as well as could be rescued with co-injection of vldlr messenger RNA. Developmental malformations were seen additionally at heart and swim bladder. Movement control was impaired in morphants as they exhibited increased spontaneous movement in embryonic stages and decreased sensory response at larval stages. Finally, morphant embryos downregulated various brain development-related genes in addition to upregulated processes of lipid metabolism.

Conclusions: The importance of vldlr becomes apparent as it is retained in vertebrates with high homology, simultaneously allowing efficient translational research in model organism zebrafish. Here, creation of vldlr knockdown model in zebrafish larvae was successful. By suppressing Reelin signals, vldlr morphants have global deficits in neuronal progenitor cell migration and formation of the brain. Alterations in lipid metabolism of morphants align with previous literature but a more precise mutant model should be created to fully validate this disease model.

Tausta ja tavoitteet: Pikkuaivojen kehityshäiriöt johtavat monenlaisiin neurologisiin sairauksiin. Pikkuaivojen kehitys tapahtuu solujen erilaistumis- ja migraatiovaiheiden kautta. Esiasteisten hermosolujen kehitystä ohjaa säätelyproteiini Reelin, joka välittää signaalinsa solukalvon reseptorien kautta. Yhtä Reelin-reseptoria koodaa VLDL-reseptorin geeni vldlr. Signaali välittyy solujen sisälle aktivoiden muiden geenien ilmentymistä ja solutukirangan muutoksia, valmistaen nämä solut tulevaa migraatiota varten. Reelin-signalointi katkeaa ilman toiminnallisia reseptoreja, kuten nähdään pikkuaivojen kehityshäiriöissä, joiden oireita ovat muun muassa laaja-alainen kehitysvammaisuus ja liikehallintakyvyn aleneminen. Yksityiskohtainen signalointireittien tutkiminen voisi johtaa parempien hoitokeinojen kehitykseen. Lisäksi johdonmukaisien tautimallien kehityksellä saadaan arvokasta tietoa heterogeenisten kehityshäiriöiden syntymekanismeista. Seeprakalan pikkuaivojen kehitys on suurilta osin samankaltaista kuin ihmisellä. Kehitys tapahtuu aikaisin alkionmuodostuksen aikana, mahdollistaen tehokkaiden tautimallien luomisen. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on karakterisoida seeprakalan poikasia, joiden vldlr-geeni on hiljennetty. Lisäksi tarkoituksena on kartoittaa geenien ilmentymisen muutokset transkriptomin tasolla näissä yksilöissä.

Materiaalit ja menetelmät: vldlr-geenin evoluutionaarista muutostahtia tutkittiin bioinformatiikan työkaluilla, sekä kudosspesifien varianttien ilmentymiset selvitettiin tutkimalla geenin ilmentymistä eri kudosten ja alkionkehitysasteiden välillä. vldlr-geenin hiljentäminen seeprakalan alkioissa toteutettiin injektoimalla translaation-, sekä silmukoinnin estäviä morfoliinoja näiden ruskuaiseen. Fenotyyppimuutoksia tutkittiin viiden päivän ajan ja poikaset luokiteltiin kehityshäiriöiden runsauden perusteella. Muutoksia uintikäyttäytymisessä ja hermostollisissa vasteissa tutkittiin testiryhmien välillä. Muutoksia poikasten solumorfologiassa ja solukuoleman ilmentymisessä tutkittiin hematoksyliini-eosiini-värjäyksellä ja TUNEL-menetelmällä. Geeninhiljentämisen molekulaariset vaikutukset koko eliössä selvitettiin transkriptomin sekvensoinnilla.

Tulokset: Evoluutionaariset muutokset vldlr-geenin rakenteessa ja toiminnoissa olivat vähäisiä selkärankaisten lajien välillä. Geenivariantit ilmentyivät useissa eri elimissä, mutta vahvin ilmentyminen oli tyypin II geenillä aivoissa ja munasarjoissa. Geenihiljennetty seeprakalan poikaspopulaatio osoitti laajoja kehityshäiriöitä aivojen, silmien, sydämen ja uimarakon alueella. Häiriöiden taajuus oli riippuvainen käytetystä morfoliinopitoisuudesta ja fenotyyppi oli pelastettavissa in vitro syntetisoidulla vldlr:n lähetti-RNA:lla. vldlr-hiljennettyjen seeprakalojen liikekoordinaatio oli muuttunutta villityyppiin verrattuna, alkionaikaisen spontaanin liikkeen kasvaessa ja aistinvaraisen kosketusvasteen laskiessa poikasvaiheessa. Hiljennetyn populaation yksilöt ali-ilmentivät useita aivojen kehitykseen liittyviä geenejä ja toisaalta yli-ilmentivät rasvahappometaboliaan liittyviä geenejä.

Johtopäätökset: vldlr-geenin rooli on ilmeisen keskeinen, sillä se on säilynyt selkärankaisissa lähes muuttumattomana. Tämä mahdollistaa myös luotettavien tautimallien kehittämisen mallieliöissä, kuten seeprakalassa. Tämän tutkimuksen tuloksena vldlr geeni hiljennettiin onnistuneesti seeprakalan poikasista. Kyseiset poikaset ilmentävät laajoja häiriöitä esiasteisten hermosolujen elinkierrossa sekä aivojen muodostuksessa, mitä luultavammin Reelin-signaloinnin häiriöiden seurauksena. Lisäksi rasvahappojen aineenvaihdunnan geeni-ilmentymisen muutokset vahvistavat tautimallin biologista merkitystä. Tarkemman ja validoidun tautimallin kehittäminen vaatii mutanttilinjan luomista tulevaisuudessa.