Targeting adult retinal pigment epithelial cells with tissue-specific hypoxia-inducible transgenes for gene therapy treatments of age-related macular degeneration
Ruohonen, Julia (2018)
Tässä tietueessa ei ole kokotekstiä saatavilla Treposta, ainoastaan metadata.
Ruohonen, Julia
2018
Bioteknologian tutkinto-ohjelma - Degree Programme in Biotechnology
Lääketieteen ja biotieteiden tiedekunta - Faculty of Medicine and Life Sciences
Hyväksymispäivämäärä
2018-05-15
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:uta-201806192035
https://urn.fi/URN:NBN:fi:uta-201806192035
Tiivistelmä
Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Retinan pigmenttiepiteelisolut (RPE) ovat tärkeitä normaalille näköaistille. Silmänpohjan ikärappeumassa RPE-soluja häviää tai ne muuttuvat toimimattomiksi, mikä johtaa fotoreseptoreiden rappeutumiseen ja peruuttamattomaan näön heikkenemiseen. Silmänpohjan ikärappeuma on monisyinen sairaus, ja vaikka se on laajalti tutkittu, siihen ei ole saatavilla parantavaa hoitoa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa mahdollisia kantasolu- tai esisoluja ihmisen RPE-kerroksessa. Toisena tavoitteena oli kohdistaa aikuisia RPE-soluja kudos-spesifisten, hypoksia-säädeltyjen geenien avulla, joita voitaisiin käyttää terapeuttisena hoitona silmänpohjan ikärappeumassa.
Menetelmät: Ihmisen RPE/suonikalvo -kompleksit eristettiin ja immunovärjättiin käyttäen neljää vasta-ainetta: bestrophin, nestin, Pax6 ja Chx10. Lisäksi bestrophin-promoottoria välittäviä, hypoksia-säädeltyjä prolyyli hydroksylaasi domeenivariantteja (PHD)2 kloonattiin ekspressoimaan hypoksiaa aiheuttavan tekijän (HIF) negatiivista säätelyä. Vaihtoehtoisten PHD2-geenivarianttien RPE-spesifistä ekspressointia analysoitiin ja määritettiin käyttäen Western blotia ja densitometriaa. Lopuksi PHD2-geenivarianttien tehokkuutta korreloitiin endogeeniseen HIF-1α:n ekspressioon.
Tutkimustulokset: Esisolujen olemassaolo ihmisen RPE-kerroksessa identifioitiin immunohistofluoresenssilla, mikä osoitti positiivisen nestin-, Pax6-, ja Chx10-värjäyksen ja negatiivisen bestrophin-värjäyksen. Lisäksi bestrophin-positiivisuus kytkettiin aikuisiin RPE-soluihin. Hypoksiaa indusoivilla tehostajilla ja hapesta riippuvilla degroneilla säädeltyjen PHD2-geenivarianttien kloonaus onnistuttiin liittämään pVMD2-vektoriin, joka on sopiva adenoviruksen tuotannnossa. Tulosten perusteella pVMD2-ohjattu PHD2-säätely degronien avulla on paras kandidaatti silmänpohjan ikärappeuman geeniterapialle.
Johtopäätökset: Tämä tutkimus esittää tekniikan, jolla voidaan eristää RPE/suonikalvo -kompleksi ihmisen silmästä. Lisäksi tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa raportoidaan esisoluista ihmisen RPE-kerroksessa. Bestrophinin ekspressio liitettiin ihmisen aikuisiin RPE-soluihin, mikä viittaa siihen, että bestrophinin promoottori VMD2 toimii RPE-spesifisenä promottorina, joka voidaan ottaa potentiaaliseen käyttöön geeniterapian kliinisissä tutkimuksissa. Nämä tulokset antavat näyttöä tulevaisuuden terapeuttisten strategoiden suunnittelulle ja vakaalle silmänpohjan ikärappeuman hoidolle. Background and aims: The retinal pigment epithelium (RPE) cells are paramount for normal vision. In age-related macular degeneration (AMD), dysfunction and loss of these cells leads to degeneration of photoreceptors, and therefore irreversible loss of vision. Development of AMD is a complex and multifactorial and albeit it is widely studied, there is no completely curative treatment available. The aim of this study was to identify the possibility of stem cell- or progenitor-like cells present within the human RPE layer. Moreover, the second aim was to target adult RPE cells with tissue-specific hypoxia-regulated genes with therapeutic benefit for age-related macular degeneration.
Methods: Human RPE/choroid complexes were dissected and immunostained by free-floating flatmount technique with four antibodies: bestrophin, nestin, Pax6, and Chx10. In addition, cloning of a bestrophin promoter-mediated, hypoxia-regulated prolyl hydroxylase domain variants (PHD)2 were cloned to express the negative regulation of hypoxia-inducible factor (HIF). The expression of the alternative PHD2 gene variants were analyzed by Western blot and quantified using densitometry. Finally, the effectiveness of PHD2 gene variants were correlated with the expression of endogenous HIF-1α.
Results: The presence of progenitor-like cells were identified within the human RPE layer by immunohistofluorescence, displaying nestin-, Pax6-, and Chx10-positive and bestrophin-negative staining. In addition, bestrophin-positivity was related to RPE cell maturity and adultness. Cloning of PHD2 variant transgenes regulated by hypoxia-inducible enhancers or oxygen-dependent degrons was achieved into a pVMD2 backbone, suitable for production of adeno-associated virus. Based on this study, results show that pVMD2-driven PHD2 regulation by degrons is the best candidate for gene therapy of AMD.
Conclusions: This thesis presents technique on isolation of RPE/choroid complexes from human eye. Moreover, this is the first study to report the presence of progenitor-like cells within the human RPE layer. Expression of bestrophin was related to an adult state of human RPE cells, suggesting the VMD2 promoter of bestrophin is a bona fide adult RPE-specific promoter with potential use for gene therapy in the clinic. These results have implications on the design of future therapeutic strategies for the sustainable treatment of age-related macular degeneration.
Menetelmät: Ihmisen RPE/suonikalvo -kompleksit eristettiin ja immunovärjättiin käyttäen neljää vasta-ainetta: bestrophin, nestin, Pax6 ja Chx10. Lisäksi bestrophin-promoottoria välittäviä, hypoksia-säädeltyjä prolyyli hydroksylaasi domeenivariantteja (PHD)2 kloonattiin ekspressoimaan hypoksiaa aiheuttavan tekijän (HIF) negatiivista säätelyä. Vaihtoehtoisten PHD2-geenivarianttien RPE-spesifistä ekspressointia analysoitiin ja määritettiin käyttäen Western blotia ja densitometriaa. Lopuksi PHD2-geenivarianttien tehokkuutta korreloitiin endogeeniseen HIF-1α:n ekspressioon.
Tutkimustulokset: Esisolujen olemassaolo ihmisen RPE-kerroksessa identifioitiin immunohistofluoresenssilla, mikä osoitti positiivisen nestin-, Pax6-, ja Chx10-värjäyksen ja negatiivisen bestrophin-värjäyksen. Lisäksi bestrophin-positiivisuus kytkettiin aikuisiin RPE-soluihin. Hypoksiaa indusoivilla tehostajilla ja hapesta riippuvilla degroneilla säädeltyjen PHD2-geenivarianttien kloonaus onnistuttiin liittämään pVMD2-vektoriin, joka on sopiva adenoviruksen tuotannnossa. Tulosten perusteella pVMD2-ohjattu PHD2-säätely degronien avulla on paras kandidaatti silmänpohjan ikärappeuman geeniterapialle.
Johtopäätökset: Tämä tutkimus esittää tekniikan, jolla voidaan eristää RPE/suonikalvo -kompleksi ihmisen silmästä. Lisäksi tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa raportoidaan esisoluista ihmisen RPE-kerroksessa. Bestrophinin ekspressio liitettiin ihmisen aikuisiin RPE-soluihin, mikä viittaa siihen, että bestrophinin promoottori VMD2 toimii RPE-spesifisenä promottorina, joka voidaan ottaa potentiaaliseen käyttöön geeniterapian kliinisissä tutkimuksissa. Nämä tulokset antavat näyttöä tulevaisuuden terapeuttisten strategoiden suunnittelulle ja vakaalle silmänpohjan ikärappeuman hoidolle.
Methods: Human RPE/choroid complexes were dissected and immunostained by free-floating flatmount technique with four antibodies: bestrophin, nestin, Pax6, and Chx10. In addition, cloning of a bestrophin promoter-mediated, hypoxia-regulated prolyl hydroxylase domain variants (PHD)2 were cloned to express the negative regulation of hypoxia-inducible factor (HIF). The expression of the alternative PHD2 gene variants were analyzed by Western blot and quantified using densitometry. Finally, the effectiveness of PHD2 gene variants were correlated with the expression of endogenous HIF-1α.
Results: The presence of progenitor-like cells were identified within the human RPE layer by immunohistofluorescence, displaying nestin-, Pax6-, and Chx10-positive and bestrophin-negative staining. In addition, bestrophin-positivity was related to RPE cell maturity and adultness. Cloning of PHD2 variant transgenes regulated by hypoxia-inducible enhancers or oxygen-dependent degrons was achieved into a pVMD2 backbone, suitable for production of adeno-associated virus. Based on this study, results show that pVMD2-driven PHD2 regulation by degrons is the best candidate for gene therapy of AMD.
Conclusions: This thesis presents technique on isolation of RPE/choroid complexes from human eye. Moreover, this is the first study to report the presence of progenitor-like cells within the human RPE layer. Expression of bestrophin was related to an adult state of human RPE cells, suggesting the VMD2 promoter of bestrophin is a bona fide adult RPE-specific promoter with potential use for gene therapy in the clinic. These results have implications on the design of future therapeutic strategies for the sustainable treatment of age-related macular degeneration.