The Role of ROR1 Pseudokinase Signaling in Cancer

Abstract

Reseptorityrosiinikinaasin kaltainen orporeseptori 1 (ROR1) on Wnt-signalointiin liitetty solukalvoreseptori, joka luokitellaan pseudokinaasiksi johtuen poikkeamista kinaasidomeenin aktiivisuuteen vaadittavissa konsensusmotiiveissa. Vaikka ROR1 on alun perin määritelty orporeseptoriksi, Wnt5a on sittemmin vakiintunut sen ligandiksi. Normaalisti ROR1-reseptoria ilmennetään lähinnä yksilönkehityksen aikana, ja sen ilmentyminen terveen aikuisen kudoksissa on vähäistä. ROR1- reseptoria havaitaan kuitenkin solujen pinnalla useissa eri syöpätyypeissä.

ROR1-reseptorin on osoitettu edistävän syöpäsolujen kasvua, liikkumista ja tunkeutumista ympäröiviin kudoksiin. Reseptorin korkea ilmentymistaso korreloi usein huonon ennusteen kanssa, ja ROR1 saattaa myötävaikuttaa myös lääkeresistenssin kehittymiseen. Viime vuosina kiinnostus ROR1-reseptoria vastaan kohdennettujen hoitojen kehittämiseen on lisääntynyt, ja muutamat lupaavat hoitotavat ovat jo edenneet kliinisiin kokeisiin. Varsinaisista ROR1-reseptorin aktivoimista solunsisäisistä signalointireiteistä tiedetään kuitenkin suhteellisen vähän. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin ROR1-signalointia manttelisolulymfoomassa (MCL), B-solulinjan akuutissa lymfaattisessa leukemiassa (BCP-ALL) ja epiteliaalisessa munasarjasyövässä (EOC) käyttäen solulinjamalleja ja <i>ex vivo</i> -primäärisoluja. Valikoiduista solulinjoista tuotettiin stabiilit indusoitavat shRNA- solulinjat, joiden avulla selvitettiin ROR1-reseptorin ilmentymisen vaimentamisen vaikutuksia syöpäsolujen elinvoimaisuuteen ja mahdollisesti ROR1-signalointiin osallistuvien proteiinien ilmentymiseen. EOC-malleissa tutkittiin myös glukokorti- koidi deksametasonin vaikutuksia ROR1-reseptorin ilmentymiseen ja signalointiin sekä solujen kemoresistenssiin. Lisäksi ROR1-reseptorin vaikutuksia syöpäsolujen lääkeherkkyyteen selvitettiin ROR1 shRNA-solulinjojen avulla hyödyntäen DSRT (drug sensitivity and resistant testing) -alustaa.

Kaikissa kolmessa tutkitussa syöpätyypissä ROR1-reseptorin ilmentyminen oli vaihtelevaa. Saadut tulokset vahvistivat myös aiempia havaintoja Wnt5a-ligandin sitoutumisesta ROR1-reseptoriin ja sen kyvystä aktivoida ROR1-välitteistä signalointia. Pienet GTPaasit RhoA ja Rac-1 havaittiin mahdollisina ROR1-signaalin edelleenvälittäjinä tutkituissa syöpätyypeissä. ROR1-signalointia välittävät myös kinaasit AKT, MEK ja ERK. Lisäksi ROR1-välitteinen signalointi kytkeytyy NF-κB- signalointiin MCL:ssa. EOC-malleissa ROR1-reseptorin vaimentaminen laski myös YAP/TAZ- ja BMI-1-proteiinien tasoja. Toisaalta solujen glukokortikoidi altistus lisäsi ROR1-reseptorin ilmentymistä ja samalla lisääntyi YAP/TAZ- ja BMI-1- proteiinien ilmentyminen. DSRT-tulosten perusteella ROR1-reseptoria vastaan kohdennettujen hoitojen yhdistäminen Bcl-2-inhibiittori venetoclaxiin B- solulymfoomien/leukemioiden hoidossa tai SMAC-mimeetteihin munasarjasyövän hoidossa saattaisi olla yksittäisiä lääkeaineita tehokkaampi vaihtoehto syöpäsoluja vastaan.

Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1) is a Wnt signaling associated cell surface receptor that is classified as pseudokinase due to the alterations in kinase domain consensus motifs required for kinase activity. Although originally defined as an orphan receptor, Wnt5a is now established as a ligand for ROR1. Normally, ROR1 is mainly expressed during the development, and in the tissues of healthy adults its expression is minimal. However, ROR1 is expressed in many cancers, both hematological and solid malignancies.

ROR1 has been shown to promote cancer cell proliferation, migration and invasion. High ROR1 expression often correlates with a poor prognosis and ROR1 can even contribute to the development of drug resistance. In recent years, interest towards developing ROR1-targeted cancer therapies has been increasing and some successful approaches are already undergoing clinical trials. Still, relatively little is known about the actual signaling pathways activated downstream of ROR1.

For this thesis, ROR1 signaling was studied in mantle cell lymphoma (MCL), B- cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL) and epithelial ovarian cancer (EOC) using cell line models and ex vivo primary cells. To study the effects of ROR1 downregulation, stable inducible ROR1 shRNA cell lines were generated from selected cell lines and used to analyze cell viability and the levels of putative downstream signaling proteins. For EOC models, the effects of glucocorticoid dexamethasone on ROR1 expression, signaling, and chemoresistance were also investigated. Finally, the drug sensitivity and resistance testing (DSRT) platform was used to explore how the ROR1 silencing affects the drug sensitivities of cancer cells. ROR1 expression was found to be heterogeneous in all studied cancer types. The binding of Wnt5a to ROR1 and its ability to induce ROR1-mediated downstream signaling was also further confirmed in MCL, BCP-ALL, and EOC. Small GTPases RhoA and Rac-1 were most consistently detected as possible ROR1 downstream effectors. ROR1 signaling was also conveyed through kinases AKT, MEK, and ERK. Additionally, ROR1 associates with NF-κB signaling in MCL and with transcriptional regulators YAP/TAZ and BMI-1 in EOC. YAP/TAZ and BMI-1 were also upregulated after a glucocorticoid treatment that increased ROR1 expression in EOC cells as well. The most notable findings from the DSRT indicate that combining ROR1-targeted therapies to Bcl-2 inhibitor venetoclax in B-cell malignancies or to SMAC-mimetics in EOC could have increased anti-cancer efficacy compared to single agent treatments.