Solunulkoisten vesikkelien solunsisäisen kulkeutumisen tutkiminen FLIM-FRET-tekniikalla

Abstract

Solunulkoiset vesikkelit ovat lähes kaikkien solutyyppien tuottamia nanokokoisia partikkeleita, jotka toimivat solujen välisen viestinnän välineinä. Näiden bioyhteensopivien rakenteiden potentiaalinen käyttö diagnostisissa ja terapeuttisissa sovelluksissa sekä lääkeaineenkuljettajina on herättänyt paljon kiinnostusta. Solunulkoisten vesikkelien kulkeutumisen mekanismeja ei kuitenkaan tunneta vielä hyvin. Solunulkoisia vesikkeleitä voidaan helposti leimata fluoresoivilla merkkiaineilla, jolloin vesikkelien kulkeutumista voidaan tutkia fluoresenssimikroskopialla.

Försterin resonanssienergiansiirto on prosessi, jossa yksi virittynyt molekyyli, donori, siirtää energiansa säteilemättömästi toiselle perustilassa olevalle molekyylille, akseptorille. Energiansiirron tehokkuus riippuu donorin ja akseptorin etäisyydestä toisistaan. Försterin resonanssienergiansiirron tehokkuus voidaan mitata donorin fluoresenssin elinajan lyhenemisestä ja donorin ja akseptorin etäisyys toisistaan on mahdollista laskea tästä tehokkuudesta, jos parin Försterin etäisyys tunnetaan. Försterin etäisyys on se donorin ja akseptorin välinen etäisyys, jolla resonanssienergiansiirron tehokkuus on 50 % ja se on laskettavissa donorin ja akseptorin spektroskopisista ominaisuuksista.

Tässä työssä solunulkoisten vesikkelien solunsisäistä kulkeutumista yritettiin tutkia Försterin resonanssienergiansiirron avulla leimaamalla tutkittavat solut akseptorilla ja solunulkoiset vesikkelit donorilla. Donoreina käytettiin roottori-BODIPY-merkkiainetta ja Oregon Green™:llä leimattua paklitakselia ja akseptoreina käytettiin TMRE:tä ja LysoTracker™ Deep Rediä. Leimattuja soluja ja solunulkoisia vesikkeleitä kuvattiin elinaikaerotteisella fluoresenssimikroskoopilla ja kuvista pyrittiin havaitsemaan donorin elinajan lyhenemistä akseptorilla leimatuilla alueilla.

Solumittauksia ennen tehtiin myös merkkiaineiden karakterisointimittauksia P123-miselleissä. Roottori-BODIPY:lle, Oregon Green™ 488 kadaveriinillle ja TMRE:lle tehtiin fluoresenssin elinaika- ja intensiteettimittauksia. Mittauksia tehtiin siten, että miselleissä oli vain yhtä merkkiainetta ja siten että miselleissä oli donoria ja akseptoria. Sekä P123:n ja akseptorin määrän vaikutusta donorien fluoresenssin elinaikaan ja intensiteettiin tutkittiin. Käytetyille donori-akseptori-pareille laskettiin myös Försterin etäisyydet tehtyjen mittausten pohjalta.

Tutkimuksessa havaittiin, että resonanssienergiansiirtoa tapahtui miselleissä vain vähän roottori-BODIPY:n ja TMRE:n välillä eikä ollenkaan Oregon Green™ 488 kadaveriinin ja TMRE:n välillä. Solumittauksissakaan ei havaittu donorin elinajan lyhenemistä, eikä solunulkoisten vesikkelien kulkeutumisen tarkempi tutkiminen näin ollen onnistunut. Työssä tuli ilmi haasteita resonanssienergiansiirron käyttämisessä vesikkeleiden kulkeutumisen tutkimisessa. Tekniikka saattaa kuitenkin olla käyttökelpoinen tutkimusmenetelmä, jos kaikki haasteet saadaan ratkaistua.

Extracellular vesicles are nanosized particles that are secreted by almost all types of cells and they function as mediators in intercellular communication. The potential use of these biocompat-ible structures in diagnostic and therapeutic applications and as drug delivery systems has gath-ered a lot of interest in the recent years. The mechanism of the cellular uptake and intracellular trafficking of extracellular vesicles are not yet known well, however. The vesicles can be easily labeled with fluorescent labels which makes it possible to study their uptake and trafficking with fluorescence microscopy.

Förster resonance energy transfer is a process where an excited molecule, the donor, trans-fers its energy to a ground state molecule, the acceptor, through a nonradiative dipole-dipole coupling. The efficiency of energy transfer depends on the distance between the donor and the acceptor. The efficiency of Förster resonance energy transfer can be measured from the short-ening of the fluorescence lifetime of the donor and the distance between the donor and the ac-ceptor can be calculated from this, as long as the Förster distance of the donor-acceptor pair is known. The Förster distance is the distance between the donor and the acceptor at which the efficiency of resonance energy transfer is 50 % and it can be calculated from the spectroscopic properties of the donor and the acceptor.

The aim of this master’s thesis was to study the intracellular trafficking of extracellular vesicles using Förster resonance energy transfer by labeling cells with an acceptor and the extracellular vesicles with a donor. The donors were a rotor-BODIPY dye and paclitaxel labeled with Oregon Green™ and the acceptors were TMRE and LysoTracker™ Deep Red. The labeled cells and extracellular vesicles were imaged using fluorescence lifetime imaging microscopy and the pres-ence of resonance energy transfer was evaluated from the changes in donor lifetime.

Before measurements in live cells the fluorescent properties of the dyes were studied in P123-micelles. The fluorescence lifetime and intensities were measured for the rotor-BODIPY, Oregon Green™ 488 cadaverine and TMRE. The measurements were done for samples with only one fluorophore and for samples where both a donor and an acceptor were present at the same time. The effect of the amount of P123 and acceptor on the fluorescent properties of the donors were studied. The Förster distances for the used donor-acceptor pairs were also calculated.

According to the obtained results only a little resonance energy transfer was observed in the micelles between the rotor-BODIPY and TMRE and none between Oregon Green™ 488 cadav-erine and TMRE. No energy transfer was detected in the live cells and thus the trafficking of extracellular vesicles to the target cell organs could not be verified. During this work it became evident that using resonance energy transfer in the study of intracellular trafficking of extracellular vesicles is challenging. The technique could still be a viable method in this kind of study if the challenges can be solved and overcome.