Characterization of Wnt5a-ROR Pathway in Cisplatin-resistant Ovarian Cancer Cell Lines
Kaleva, Laura (2020)
2020
Bioteknologian ja biolääketieteen tekniikan maisteriohjelma - Master's Programme in Biotechnology and Biomedical Engineering
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2020-12-03
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202011137958
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202011137958
Tiivistelmä
Background and aims: Epithelial ovarian cancers (OC), of which 70–80% are high-grade serous ovarian cancer (HGSOC), are the leading cause of gynecological cancer deaths in developed countries. Currently, the standard OC treatment is cytoreductive surgery followed by platinum-based chemotherapy and taxane agents such as paclitaxel. Chemoresistance contributes greatly to the poor prognosis of OC patients and the five-year survival rate in HGSOC is less than 40%. Therefore, novel therapeutic approaches are highly needed to improve patient outcomes.
ROR (Receptor tyrosine kinase-like Orphan Receptor) family of proteins belongs to the non-canonical Wnt pathway and comprises of two receptors, ROR1 and ROR2, that are able to bind Wnt5a ligand via their extracellular domain. In OC, both ROR1 and ROR2 are important for cell growth, migration, and invasion, while high levels of ROR2 correlated with platinum resistance. ROR1 is a prognostic marker for shorter overall survival of OC patients.
In this study, we aimed to understand how expression of ROR1 and ROR2 is related to cisplatin resistance and how targeting ROR1 or ROR2 expression affects OC cell survival.
Methods: Experiments were performed on commercially available OC cell lines. Cisplatin sensitivity was investigated via cell proliferation. Cell lines were characterized by Western blotting for the expression of signaling pathways such as Wnt5a-ROR1/ROR2/PTK7, AKT/PI3K, EMT, Wnt/Ca2+ and stem cell pathways. The effects of silencing ROR1 and ROR2 expression were investigated with shRNA. Wnt5a stimulation was done to investigate changes in phosphoprotein expression of AKT and ERK pathway.
Results: We analyzed the expression of Wnt5a-ROR1/ROR2 in OC cell lines based on their cisplatin sensitivity. Wnt5a/ROR2 was upregulated in OVCAR3cis compared to parental cell line. ROR2 was also upregulated in A2780cis compared to A2780 parental cell line. Targeting ROR1 downregulated STAT3 in A2780cis. pERK was upregulated in cisplatin-resistant Kuramochi cells after Wnt5a stimulation.
Conclusions: We observed upregulation of Wnt5a-ROR pathway by Western blotting in OVCAR3cis and A2780cis compared to parental cell lines, suggesting that acquired cisplatin resistance could be involved in changes in non-canonical Wnt signaling via ROR receptors. This will also mean that targeting these receptors in cisplatin resistant cells should be considered as a possible therapeutic approach. Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Epiteeliset munasarjasyövät (OC), joista 70-80% on alatyypiltään huonosti erilaistunutta seroosia karsinoomaa (HGSOC), ovat kehittyneiden maiden johtava gynekologisten syöpäkuolemien aiheuttaja. Tällä hetkellä standardihoitona on sytoreduktiivinen leikkaus ja sitä seuraava platinapohjainen kemoterapia yhdistettynä taksaaneihin kuten paklitakseliin. HGSOC:ta sairastavista potilaista alle 40% on elossa viiden vuoden kuluttua diagnoosista. Kemoresistenssi on merkittävä huonoon ennusteeseen johtava tekijä, minkä vuoksi uusien hoitokeinojen löytäminen on tarpeen potilaiden ennusteiden parantamiseksi.
ROR-proteiiniperhe (Receptor tyrosine kinase-like Orphan Receptor) on osa ei-kanoonista Wnt-signalointia ja koostuu ROR1- ja ROR2-reseptoreista, jotka pystyvät sitomaan Wnt5a-ligandin solunulkoisella domeenillaan. OC:ssa molemmat reseptorit ovat tärkeitä solun kasvun, migraation ja invaasion kannalta ja lisäksi ROR2:n korkea määrä korreloi platinaresistenssin kanssa. ROR1 puolestaan on huonon ennusteen markkeri OC:ssa.
Tässä tutkimuksessa pyrimme ymmärtämään ROR1:n ja ROR2:n ilmentymisen vaikutusta sisplatiiniresistenssiin ja selvittämään, kuinka ROR1:n tai ROR2:n hiljentäminen vaikuttaa kemoresistenttien OC-solujen selviämiseen.
Menetelmät: Kokeisiin käytettiin kaupallisia OC-solulinjamalleja. Sisplatiinisensitiivisyyttä tutkittiin solujen jakautumisnopeuden perusteella. Solulinjoja karakterisoitiin Western-blottauksella eri signalointireittien osalta; näihin lukeutuivat Wnt5a-ROR1/ROR2/PTK7-, AKT/PI3K-, EMT- ja Wnt/Ca2+-reitit sekä kantasolusignalointi. ROR1:n ja ROR2:n hiljentämisen vaikutuksia tutkittiin käyttämällä shRNA:ta. Wnt5a-stimulaatiolla tutkittiin muutoksia AKT- ja ERK-proteiinien fosforylaatiossa.
Tutkimustulokset: Analysoimme Wnt5a-ROR1/ROR2-reitin ilmentymistä OC-solulinjoissa niiden sisplatiinisensitiivisyyden perusteella. Wnt5a/ROR2:n ilmentyminen kasvoi OVCAR3cis-soluissa ja ROR2:n ilmentyminen kasvoi A2780cis-soluissa verrattuna parentaalisolulinjoihin. ROR1:n hiljentäminen vähensi STAT3:n ilmentymistä A2780cis-soluissa. Wnt5a-stimulaatio kasvatti ERK-fosforylaatiota sisplatiiniresistenteissä Kuramochi-soluissa.
Johtopäätökset: Havaitsimme Western-blottauksen avulla, että Wnt5-ROR-signaloinnin aktiivisuus kasvoi OVCAR3cis- ja A2780cis-soluissa verrattuna parentaalisolulinjoihin. Tämän perusteella sisplatiiniresistenssillä ja ei-kaanonisella Wnt-ROR-signaloinnilla saattaa olla yhteys. Näihin reseptoreihin kohdistuvia hoitoja tulisi siksi pitää potentiaalisena lähestymistapana sisplatiiniresistenttien syöpäsolujen hoidossa.
ROR (Receptor tyrosine kinase-like Orphan Receptor) family of proteins belongs to the non-canonical Wnt pathway and comprises of two receptors, ROR1 and ROR2, that are able to bind Wnt5a ligand via their extracellular domain. In OC, both ROR1 and ROR2 are important for cell growth, migration, and invasion, while high levels of ROR2 correlated with platinum resistance. ROR1 is a prognostic marker for shorter overall survival of OC patients.
In this study, we aimed to understand how expression of ROR1 and ROR2 is related to cisplatin resistance and how targeting ROR1 or ROR2 expression affects OC cell survival.
Methods: Experiments were performed on commercially available OC cell lines. Cisplatin sensitivity was investigated via cell proliferation. Cell lines were characterized by Western blotting for the expression of signaling pathways such as Wnt5a-ROR1/ROR2/PTK7, AKT/PI3K, EMT, Wnt/Ca2+ and stem cell pathways. The effects of silencing ROR1 and ROR2 expression were investigated with shRNA. Wnt5a stimulation was done to investigate changes in phosphoprotein expression of AKT and ERK pathway.
Results: We analyzed the expression of Wnt5a-ROR1/ROR2 in OC cell lines based on their cisplatin sensitivity. Wnt5a/ROR2 was upregulated in OVCAR3cis compared to parental cell line. ROR2 was also upregulated in A2780cis compared to A2780 parental cell line. Targeting ROR1 downregulated STAT3 in A2780cis. pERK was upregulated in cisplatin-resistant Kuramochi cells after Wnt5a stimulation.
Conclusions: We observed upregulation of Wnt5a-ROR pathway by Western blotting in OVCAR3cis and A2780cis compared to parental cell lines, suggesting that acquired cisplatin resistance could be involved in changes in non-canonical Wnt signaling via ROR receptors. This will also mean that targeting these receptors in cisplatin resistant cells should be considered as a possible therapeutic approach.
ROR-proteiiniperhe (Receptor tyrosine kinase-like Orphan Receptor) on osa ei-kanoonista Wnt-signalointia ja koostuu ROR1- ja ROR2-reseptoreista, jotka pystyvät sitomaan Wnt5a-ligandin solunulkoisella domeenillaan. OC:ssa molemmat reseptorit ovat tärkeitä solun kasvun, migraation ja invaasion kannalta ja lisäksi ROR2:n korkea määrä korreloi platinaresistenssin kanssa. ROR1 puolestaan on huonon ennusteen markkeri OC:ssa.
Tässä tutkimuksessa pyrimme ymmärtämään ROR1:n ja ROR2:n ilmentymisen vaikutusta sisplatiiniresistenssiin ja selvittämään, kuinka ROR1:n tai ROR2:n hiljentäminen vaikuttaa kemoresistenttien OC-solujen selviämiseen.
Menetelmät: Kokeisiin käytettiin kaupallisia OC-solulinjamalleja. Sisplatiinisensitiivisyyttä tutkittiin solujen jakautumisnopeuden perusteella. Solulinjoja karakterisoitiin Western-blottauksella eri signalointireittien osalta; näihin lukeutuivat Wnt5a-ROR1/ROR2/PTK7-, AKT/PI3K-, EMT- ja Wnt/Ca2+-reitit sekä kantasolusignalointi. ROR1:n ja ROR2:n hiljentämisen vaikutuksia tutkittiin käyttämällä shRNA:ta. Wnt5a-stimulaatiolla tutkittiin muutoksia AKT- ja ERK-proteiinien fosforylaatiossa.
Tutkimustulokset: Analysoimme Wnt5a-ROR1/ROR2-reitin ilmentymistä OC-solulinjoissa niiden sisplatiinisensitiivisyyden perusteella. Wnt5a/ROR2:n ilmentyminen kasvoi OVCAR3cis-soluissa ja ROR2:n ilmentyminen kasvoi A2780cis-soluissa verrattuna parentaalisolulinjoihin. ROR1:n hiljentäminen vähensi STAT3:n ilmentymistä A2780cis-soluissa. Wnt5a-stimulaatio kasvatti ERK-fosforylaatiota sisplatiiniresistenteissä Kuramochi-soluissa.
Johtopäätökset: Havaitsimme Western-blottauksen avulla, että Wnt5-ROR-signaloinnin aktiivisuus kasvoi OVCAR3cis- ja A2780cis-soluissa verrattuna parentaalisolulinjoihin. Tämän perusteella sisplatiiniresistenssillä ja ei-kaanonisella Wnt-ROR-signaloinnilla saattaa olla yhteys. Näihin reseptoreihin kohdistuvia hoitoja tulisi siksi pitää potentiaalisena lähestymistapana sisplatiiniresistenttien syöpäsolujen hoidossa.