Biomaterial Scaffolds for Corneal Regeneration : Combining human stem cells and biomaterials for tissue engineering of the corneal epithelium and stroma

Abstract

Sarveiskalvo on silmän etuosan läpinäkyvä kudos, joka on ensisijaisen tärkeä näkökyvyllemme. Terveen silmän pinnan toiminta perustuu epiteelisolujen jatkuvaan uusiutumiseen. Limbaalinen kantasolupuutos (engl. limbal stem cell deficiency, LSCD) on vakava sarveiskalvosokeuden muoto, jossa silmän pinnan epiteelisolukon uusiutumiskyky on menetetty, esimerkiksi palo- tai kemikaalivammojen seurauksena. Kivuliasta ja toimintakykyä heikentävää LSCD:tä ei voida hoitaa perinteisillä, kuolleilta luovuttajalta saatavilla sarveiskalvosiirteillä, vaan sen hoito vaatii uusien kudosta uusivien solujen tuomisen sarveiskalvolle. Epiteelisolujen lisäksi LSCD vaurioittaa usein myös syvempää sarveiskalvon stroomakerrosta. Tästä syystä uusien solujen siirtäminen samanaikaisesti molempien solukerrosten parantamiseksi mahdollistaisi näiden potilaiden paremman hoidon.

Ihmisen erittäin monikykyisistä kantasoluista (eng. human pluripotent stem cells, hPSC) saadaan erilaistettua tehokkaasti limbaalisia epiteelin kantasoluja (eng. limbal epithelial stem cells, LESC), jotka toimivat sarveiskalvon epiteeliä uusivina soluina. Sarveiskalvon strooman hoitoon sopivista soluista ihmisen rasvan kantasolut (engl. human adipose stem cells, hASC) ovat yksi houkuttelevimmista vaihtoehdoista. Rasvan kantasoluilla on kyky muokata kehon immuunireaktioita sekä estää verisuonten uudismuodostumista, niiden saatavuus on hyvä ja eristäminen suhteellisen vaivatonta, minkä lisäksi ne pystyvät erilaistumaan sarveiskalvon strooman keratosyyteiksi. Näiden kantasolujen lääkinnällistä käyttöä varten tarvitaan kuitenkin kliiniseen käyttöön soveltuvia biomateriaaleja ja niistä tehtyjä uudenlaisia tukirakenteita molempien solutyyppien samanaikaiseen siirtämiseen sarveiskalvolle.

Tämän väitöskirjan tavoitteena oli tuottaa hydrogeelipohjaisia tukirakenteita sekä hASC- että hPSC-LESC-soluille matkien sarveiskalvon solujen järjestäytymistä ja tutkia niiden käytännön soveltuvuutta siirteiksi sarveiskalvon kudosviljelymallissa. Väitöskirjan ensimmäisessä osatyössä tutkittiin hyaluronihappopohjaisten hydrogeelien soveltuvuutta hASC-solujen viljelyyn ja siirtoon. Seuraavassa osatyössä hyaluronihappomateriaaliin lisättiin dopamiiniryhmiä, joiden avulla saatiin valmistettua kudokseen tarttuvia geelirakenteita ja pystyttiin kasvattamaan hASC-soluja sisältävän geelin pinnalle myös hPSC-LESC-solukerros. Kolmannessa osatyössä hASC ja hPSC-LESC -soluista tuotettiin sarveiskalvon stroomaa ja epiteeliä ominaisuuksiltaan muistuttavia rakenteita laseravusteisen 3D biotulostuksen avulla käyttäen kliinisiin käyttötarkoituksiin soveltuvia hydrogeeliraaka-aineita biomusteena.

Kaiken kaikkiaan tässä väitöskirjassa on kuvattu uudenlaisia menetelmiä toiminnallisten kudosteknologisten sarveiskalvosiirteiden valmistukseen epiteeli- ja stroomakerrosten korjaamiseksi. Jotta kantasolupohjaisia hoitomuotoja saataisiin tulevaisuudessa potilaskäyttöön, työssä on kiinnitetty erityistä huomiota sekä lähtömateriaalien että tuotettujen rakenteiden kliiniseen soveltuvuuteen.

Cornea is the transparent tissue in the front of the eye essential for our vision. Its normal function requires a constant turnover of new epithelial cells to maintain a healthy ocular surface. Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a severe type of corneal blindness where the normal healing capacity of the corneal epithelium is destroyed, for example due to burns or chemical trauma. This painful and debilitating condition cannot be treated with conventional transplantation of donor corneal tissue but requires the introduction of new therapeutic cells to regain the function of the cornea. In addition to the corneal epithelium, the underlying stromal layer is often also affected in LSCD, and the simultaneous delivery of regenerative cells for both corneal layers would be beneficial for treatment of these patients.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the capacity to differentiate with high efficacy to limbal epithelial stem cells (LESCs), that could provide the therapeutic cells to restore the function of the corneal epithelium. To regenerate the corneal stromal layer, human adipose stem cells (hASCs) provide an attractive cell source because of their immunomodulatory and antiangiogenic properties, relative abundance and ease of isolation, and their capacity to differentiate towards corneal keratocytes. However, for realizing their full therapeutic potential, clinically relevant biomaterial scaffolds are needed for the delivery of these two stem cell types to the cornea.

This dissertation explored the production of hydrogel-based scaffolds for hASCs and hPSC-LESCs in a corneal tissue-mimicking organization and studied their applicability for implantation to corneal wounds in an ex vivo cornea organ culture model. First, hyaluronic acid-based hydrogels were evaluated as suitable cell- encapsulation materials for hASCs. With further modification of the hyaluronic acid with dopamine moieties, tissue adhesive hydrogel implants with encapsulated hASCs and a layer of hPSC-LESCs on the surface were successfully fabricated. Lastly, laser- assisted 3D bioprinting with clinically relevant hydrogel bioinks was used to create corneal structures accurately mimicking the properties of both the stroma and the epithelium.

In conclusion, this dissertation describes innovative methods to produce functional tissue-engineered structures for the regeneration of both the epithelium and stromal layers of the cornea. With the aim of treating patients with stem cell- based therapies in the future, the clinical applicability of both the raw materials and the ready-made structures were considered throughout this work.