Effect of A-type lamins on nucleus morphology in epithelial cells: A-tyypin lamiinien vaikutus tuman muotoon epiteelisoluissa

Abstract

Background and aims: Mechanical forces are known to play essential roles in tissue ho-meostasis and development. Recently, it has been established that physical forces can travel from the extracellular matrix through the cytoskeleton into the nucleus and deform DNA-associated structures potentially altering gene expression. Lamins are type V intermediate fila-ment proteins that form the nuclear lamina and establish the physical connection between the nucleus and the cytoskeleton. Their functions are not fully understood, but they contribute to nucleus morphology and several cellular processes. Altered nucleus morphology is often a sign of a disease. A-type lamins encoded by the LMNA gene are mainly responsible for nucleus stiffness and morphology, and their mutations are linked to several diseases. The different A-type lamin isoforms result from the alternative splicing of the LMNA gene product pre-lamin A. CRISPR/Cas9 is a novel genome editing tool that can be used to generate knock-out cell mod-els to study the importance of specific genes, such as LMNA. In this thesis, the aims were to establish LMNA knockout cell line and to study the importance of A-type lamins on nucleus morphology. The working hypothesis was that the depletion of A-type lamins leads to irregular nucleus shape.

Methods: LMNA knockout cell line was established using CRISPR/Cas9. In-house pre-designed gRNAs were produced in a liquid bacterial culture and co-transfected into MDCK II cells with a transiently expressed fluorescent Cas9 endonuclease. The fluorescent cells were FACS-sorted, and the knockout was verified by western blot and immunostaining. The effect of pre-lamin A depletion on nucleus morphology was then studied by using wild type (wt) and sta-bly fluorophore-conjugated lamin-A expressing cell lines including lamin A-mutant unable to incorporate into the nuclear lamina as controls. To this end, immunostaining followed by confo-cal microscopy imaging and data analysis in ImageJ distribution Fiji and Microsoft Excel. A cus-tomized ImageJ macro was used to measure the morphological features i.e. aspect ratios of the nuclei, and cell density was analysed by calculating the nuclei in microscopy images. Cell proliferation rate was determined by culturing equal numbers of cells and counting them. Stu-dent’s T-test with a significance level 0.05 was used as a statistical measure in all the analyses.

Results: LMNA knockout cell line was successfully established by CRISPR/Cas9. The anal-ysis of the nuclear aspect ratio showed, that the pre-lamin A -depleted nuclei were mostly cres-cent- or donut-shaped, and that their circularity, roundness and solidity differed significantly from those of the wt cells. In addition, N-terminal deletion mutation of 20 amino acids or fluoro-phore tags in the lamin A protein delayed cell proliferation but didn’t remarkably affect the nu-cleus morphology. Endogenous lamin A expression was mostly unaffected by the LMNA modifi-cations. In support of the hypothesis, the results showed that the depletion of A-type lamins led to an irregular nucleus shape.

Conclusions: To conclude, the results support the hypothesis and demonstrate the im-portance of A-type lamins on nucleus morphology. The results suggest that the successfully established pre-lamin A knock-out cell line can serve as a model of laminopathies and can be used to study the importance of A-type lamins in cellular processes. It can be speculated if the depletion of A-type lamins affects the nuclear mechanotransduction. Further studies are need-ed to elucidate the mechanisms of the phenomena as well as the effects of lamin knock-out on other cellular processes, such as mechanical force transmission and gene expression.

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Mekaanisten voimien tiedetään olevan tärkeitä kudosten normaalille homeostaasille ja kehitykselle. Viime aikoina mekaanisten voimien on havaittu välit-tyvän solun ulkopuolelta solutukirangan kautta tumaan asti ja muokkaavan DNA:han sitoutunei-ta proteiineja, mikä saattaa vaikuttaa geenien ilmentymiseen soluissa. Lamiinit ovat tyypin V välikokoisia säikeitä, jotka muodostavat tumalevyn ja mahdollistavat mekaanisen linkin tuman ja solutukirangan välille. Lamiinien toimintaa ei vielä täysin ymmärretä, mutta niiden tiedetään vaikuttavan tuman muotoon ja useisiin solun toimintoihin. Muutokset tuman muodossa ovat usein merkki sairaudesta. LMNA-geenin tuottamien A-tyypin lamiinien on ajateltu olevan pää-asiassa vastuussa tuman jäykkyydestä ja muodosta. Niiden toimimattomuus liittyy useisiin sai-rauksiin. Eri A-tyypin lamiinit muodostuvat LMNA-geenin tuottaman pre-lamiini A:n vaihtoehtoi-sen silmukoinnin seurauksena. CRISPR/Cas9 on uusi perimän muokkaustyökalu, jonka avulla voidaan tutkia halutun geenin toimintaa hiljentämällä kyseinen geeni soluista. Tässä pro gradu -tutkielmassa tavoitteina oli perustaa solulinja, josta LMNA-geeni on hiljennetty CRISPR/Cas9 menetelmällä, ja lopulta tutkia A-tyypin lamiinien merkitystä tuman muodolle. Työn hypoteesina oli, että A-tyypin lamiinien puuttuminen johtaa epäsäännölliseen tuman muotoon.

Tutkimusmenetelmät: LMNA-geeni hiljennettiin soluista CRISPR/Cas9-menetelmää hyö-dyntäen. Etukäteen suunnitellut g-RNA:t tuotettiin bakteeriviljelmässä ja transfektoitiin soluihin elektroporaatiolla yhdessä väliaikaisesti ilmennettävän, fluoresoivan Cas9-endonukleaasin kanssa. Fluoresoivat solut lajiteltiin FACS-menetelmällä, ja LMNA-geenin hiljentyminen varmis-tettiin western blot - ja immunoleimausmenetelmällä. Lopulta A-tyypin lamiinien vaikutusta tu-man muotoon tutkittiin vertailemalla tuman muotosuhteita villin tyypin sekä fluoroforiin liitettyjä lamiini A:ta ilmentäviä solulinjoja kontrollina käyttäen. Analyysi tehtiin immunoleimatuista ja kon-fokaalimikroskoopilla kuvatuista näytteistä käyttäen ImageJ:n Fiji-ohjelmistoa sekä Microsoft Excel -taulukkolaskentaohjelmaa. Itse tehtyä ImageJ-makroa käytettiin tuman muotomääreiden mittaamisessa, ja solutiheyttä analysoitiin laskemalla tumien määrä mikroskoppikuvista. Solujen kasvunopeutta tutkittiin viljelemällä samat määrät soluja ja laskemalla ne. Studentin T-testiä (p-arvo 0,05) käytettiin kaikissa analyyseissä statistisen merkitsevyyden selvittämiseen.

Tulokset: LMNA -geenin hiljentäminen ja pre-lamiini A -negatiivisen solulinjan luominen on-nistui CRISPR/Cas9 menetelmää käyttäen. Hypoteesin mukaisesti pre-lamiini A -negatiivisissa soluissa tumat olivat epäsäännöllisen muotoisia. Ne muistuttivat muodoltaan kuunsirppiä tai donitsia, ja useat niiden muotomääreet, kuten korkeus ja pyöreys, erosivat merkittävästi kont-rollisoluista. Sen sijaan fluoroforiin liitettyjä tai N-terminaalisen 20 aminohapon deleetion seu-rauksena tumalevyyn yhdentymättömän lamiini A:ta ilmentävien solujen tumissa ei juurikaan havaittu muotomuutoksia, mutta solut kasvoivat selvästi hitaammin kuin villityypin solut. Huoli-matta mutatoidun tai fluoroforiin liitetyn lamiini A:n ilmentämisestä solujen oman LMNA-geeni-ilmentyminen oli normaalia. Työn tulokset tukivat hypoteesia osoittaen, että A-tyypin lamiinien puutos vaikuttaa tuman muotoon merkittävästi.

Johtopäätökset: Yhteenvetona, työn tulokset tukevat hypoteesia osoittaen A-tyypin lamii-nien tärkeyden tuman muodolle. Työ osoittaa, että onnistuneesti perustettu LMNA-negatiivinen solulinja voi toimia tautimallina tutkittaessa A-tyypin lamiinien merkitystä solujen eri toiminnoille. Voidaankin pohtia, vaikuttaako LMNA:n hiljentäminen tuman kykyyn aistia mekaanista voimaa. Lisätutkimuksia tarvitaan sekä A-tyypin lamiinien ja tuman muodon säätelyn välisten mekanis-mien selvittämiseksi että niiden hiljentämistä seuraavien vaikutusten kartoittamiseksi solun muissa toiminnoissa, kuten mekaanisen voiman välittymisessä ja geenien ilmentymisessä.