In vitro studies of composite biomaterials and human adipose stem cells in bone and tendon tissue engineering applications

Abstract

Tuki- ja liikuntaelinsairaudet sairauden tai loukkaantumisen johdosta ovat teollistuneissa maissa väestön ikääntymiseen ja ylipainoisuuteen liittyen merkittävä ja kasvava kansantaloudellinen rasite. Kudosteknologia tarjoaa kasvaviin tuki- ja liikuntaelinsovellusten tarpeisiin käyttökelpoisia ratkaisuja yhdistäen kantasoluja, biomateriaaleja sekä solujen kasvua ja erilaistumista edistäviä tekijöitä korjaamaan tai korvaamaan vaurioituneita kudoksia. Aikuisen kantasolut, kuten monikykyiset mesenkymaaliset rasvakudoksen kantasolut, ovat lupaavia kudosteknologisiin sovelluksiin perustuen niiden hyvään saatavuuteen, saantoon ja erilaistumiskykyyn useiksi solutyypeiksi, kuten rasva-, luu-, jänne-, rusto- ja lihassoluiksi tietyissä olosuhteissa. Suuria pään ja kallon alueen luupuutoksia on jo hoidettu yhdistäen rasvakudoksen kantasolut biomateriaalin ja kasvutekijöiden kanssa. Kudostyyppikohtainen toiminnallinen biomateriaalitukirakenne eli skaffoldi tukee fyysisesti ja ohjaa kantasolujen kasvua, kehitystä ja erilaistumista yhdessä kasvatusliuoksen tiettyjen liukoisten tekijöiden kemiallisen stimulaation kanssa. Komposiittibiomateriaaleista valmistettujen skaffoldien avulla voidaan yhdistää eri komponenttien hyödylliset ominaisuudet. Kolmiulotteiset (3D) skaffoldit tarjoavat erilaistuville kantasoluille luonnollista jäljittelevän kasvuympäristön.

Tämän väitöstutkimuksen tavoitteena oli kehittää uusia in vitro tuki- ja liikuntaelinsovelluksia yhdistämällä rasvakudoksen kantasolut soveltuvien biomateriaalien ja liukoisten tekijöiden kanssa luu- ja jännekudosteknologisiin sovelluksiin sekä verisuonittuneen luun kudosteknologisten sovellusten kehittämiseen. Ensimmäisessä osatyössä kehitettiin uusi tehokas solujen jänneerilaistuskasvatusliuos eli jännemedium rasvakudoksen kantasolujen jänneerilaistumista tukemaan sekä edistämään jännekudostyyppisen soluväliaineen muodostumista mekaanisilta ominaisuuksiltaan soveltuvien 3D punottujen kuitutukirakenteiden eli kuituskaffoldien avulla. Toisessa osatyössä rasvakudoksen kantasolujen luuerilaistuminen saatiin aikaan 3D hydrogeeleissä bioaktiivisesta lasista valmistetun ekstraktipohjaisen luuerilaistusmediumin sekä luuerilaistumista tukevien mekaanisten ominaisuuksien avulla. Kolmannessa osatyössä tutkittiin luuerilaistumisen lisäksi verisuoniverkoston muodostumista rasvakudoksen kantasolujen ja ihmisen napalaskimon endoteelisolujen yhteisviljelyn avulla 3D komposiittihydrogeelikasvatuksessa endoteelimediumpohjaisessa bioaktiivisesta lasista valmistetussa ekstraktimediumissa luuerilaistustekijöiden kanssa. Lisäksi työssä tutkittiin rasvakudoksen kantasolujen luuerilaistumisen tehostamista luuviljelymediumilla tapahtuvalla esikasvatuksella.

Kehitetty optimoitu jännemedium, joka sisälsi kasvu- ja erilaistumistekijä 5:tä ja L-askorbiinihappoa, edisti merkittävästi jännekudostyyppisen soluväliaineen muodostumista punotun 3D poly(96L/4D)laktidi (PLA 96/4)-kopolymeeri kuituskaffoldin kanssa verrattuna erilaisiin testattuihin mediumeihin tai erityyppiseen 3D tukirakenteeseen. Tehokkaaseen ja nopeaan rasvakudoksen kantasolujen jännekudostyyppisen soluväliaineen muodostumiseen tarvittiin sekä optimoidun jännemediumin kemiallinen stimulaatio että punottu 3D PLA 96/4- kuiturakenne. Bioaktiivisesta lasista valmistettu ekstraktipohjainen luumedium sai aikaan tehokkaan rasvakudoksen kantasolujen luuerilaistumisen ja mineralisaation ilman lisättyjä kasvutekijöitä 3D gellaanikumi (GG)- ja tyypin I kollageeni (COL)- hydrogeeliskaffoldeissa, joita verrattiin mahdollisimman vähän invasiivisen luukudosteknologisen sovelluksen kehittämiseen. Lisäksi GG:n ristisilloittaminen ionipitoisen bioaktiivisesta lasista valmistetun ekstraktin avulla lisäsi merkittävästi mineralisaatiota jopa kontrolliolosuhteessa luumediumissa. COL hydrogeelissä merkittävästi korkeampi geeniekspressio ja voimakas osteokalsiinituotanto vahvistivat tehokkaan rasvakudoksen kantasolujen luuerilaistumisen in vitro 3D hydrogeelikasvatuksessa fysiologisia olosuhteita mallintavissa olosuhteissa. 3D GG-COL -komposiittihydrogeelikasvatuksessa rasvakudoksen kantasolujen ja ihmisen napalaskimon endoteelisolujen yhteisviljelyssä havaittiin sekä luu- että endoteelimarkkereiden geeniekspressiota vertailtavina olleissa endoteelimediumpohjaisessa bioaktiivisesta lasista valmistetussa ekstraktimediumissa luuerilaistustekijöiden kanssa (BaG EM-OM) ja endoteelimediumissa (EGM-2). Voimakas hydroksiapatiittimineralisaatio ja osteokalsiinituotanto olivat havaittavaissa ainoastaan BaG EM-OM-olosuhteessa, kun taas vahva myöhäisen endoteelimarkkerin CD31 tuotanto, yhteisviljeltyjen levittäytyneiden solujen muodostamia putkirakenteita sekä varhaisia verisuoniverkostorakenteita oli nähtävissä vain EGM-2 -mediumolosuhteessa. Tulosten perusteella luuerilaistuminen ja verisuonituksen muodostuminen olivat toisensa poissulkevia prosesseja näissä kasvatusolosuhteissa yhteisviljelmässä 3D GG-COL -komposiittihydrogeeleissä.

Yhteenvetona voidaan todeta, että nämä uudet in vitro 3D kasvatusmenetelmät ovat lupaavia uusien merkittävien regeneratiivisen lääketieteen tuki- ja liikuntaelinsovelluksien kehittämistä varten.

Critical size bone defects and other musculoskeletal injuries due to illness or trauma continue to contribute to increasing health care costs in connection to the growth of the aging population and obesity related complications in the industrialized countries. Tissue engineering with stem cells, biomaterials, and soluble factors offers feasible solutions to ease the growing need for suitable musculoskeletal implants with the promise of stem cell therapies to remedy failure or lack of tissue function. Adult stem cells, such as multipotent mesenchymal stem cells of adipose tissue, are easily available and abundant stem cells. Human adipose stem cells (hASCs) have the potential to differentiate towards besides adipogenic, also osteogenic, tenogenic, chondrogenic, and myogenic lineages in specific conditions. Critical size bone defects of maxillofacial area have already been treated by combining hASCs with biomaterials and growth factors. A tissue specific functional biomaterial supporting structure, a scaffold, offers physical support and guides stem cell growth, development, and differentiation in combination with the chemical induction provided by specific soluble factors of cell culture media. In particular, the composite biomaterial scaffolds offer an attractive alternative in order to harness the combined feasible properties of the different components. Moreover, the three-dimensional (3D) scaffold offers the differentiating stem cells a microenvironment mimicking the natural.

The aim of this thesis was to investigate novel in vitro musculoskeletal applications combining hASCs with suitable biomaterials and soluble factors for bone and tendon tissue engineering and vascularized bone construct applications. Firstly, tenogenic medium (TM) was optimized to support tenogenic differentiation of hASCs and used to induce formation of tendon-like matrix on mechanically suitable braided 3D polymer scaffolds. Secondly, 3D hydrogels supportive of hASC osteogenic differentiation were tested in combination with bioactive glass (BaG) extract based osteogenic medium (BaG OM) with support from evolving hydrogel mechanical properties. Thirdly, concomitant matrix mineralization and microvascularization formation were investigated in composite 3D hydrogels with hASC and human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) coculture by comparing BaG extract based endothelial-osteogenic medium (BaG EM-OM) and endothelial cell growth medium-2 (EGM-2) together with assessing the effect of osteogenic preconditioning of hASCs.

The results showed that the optimized TM with both growth and differentiation factor-5 and L-ascorbic acid together with the support of 3D braided poly(L/D) lactide (PLA) 96L/4D copolymer filament scaffolds significantly enhanced tendon-like matrix production of hASCs compared to other tested media groups or different 3D scaffold structure. The combined optimized chemical support of TM and 3D mechanical support of PLA 96/4 were shown essential for efficient and fast tendon-like matrix formation by hASCs.

In 3D hydrogels, robust hASC osteogenic differentiation and mineralization with BaG OM without any added growth factors was reported. Natural polymers collagen type I (COL) and gellan gum (GG) hydrogels were compared for hASC osteogenic induction for minimally invasive bone tissue engineering applications. In addition, ionic crosslinking of GG with the BaG extract was tested and was found to significantly increase mineralization even in the control condition of regular osteogenic medium. While both the hydrogels elicited strong hASC mineralization, hASCs embedded in COL with the BaG OM induction showed significantly higher gene expression of osteogenic marker genes, and also strong immunocytochemical staining of late osteogenic marker osteocalcin (OCN) was observed, thus confirming efficacious hASC osteogenic differentiation in in vitro 3D hydrogel culture mimicking physiological conditions.

In 3D GG-COL composite hydrogels in hASC-HUVEC coculture, both BaG EM-OM and EGM-2 media supported osteogenic as well as endothelial marker gene expression. Whereas hydroxyapatite mineralization and strong OCN staining were detected in the BaG EM-OM condition, in comparison, strong production of mature endothelial marker CD31 and elongated tube-like structures of hASCs and HUVECs with initial prevascular network formation were apparent in the EGM-2 condition. However, osteogenesis and vasculogenesis processes were deemed mutually inhibitory in these conditions in coculture in 3D GG-COL composite hydrogels.

In conclusion, these novel methods for in vitro 3D culture have potential for considerable future significance and impact on the field of musculoskeletal regenerative medicine applications.