Surface-selective Luminescence Methods : Enabling technologies for rapid immunoassays and chemical sensing in cell cultures

Abstract

Luminesenssiin perustuvia mittaustekniikoita hyödynnetään laajasti kemiallisissa ja biokemiallisissa määrityksissä, anturisovelluksissa ja kuvantamisessa, ja ne ovat vakiinnuttaneet paikkansa erityisesti biotekniikan ja lääketieteellisen diagnostiikan alalla. Lisäksi tekniikkaa käytetään hyödyksi monissa ympäristö- ja turvallisuussovelluksissa kuten viranomaisten tekemissä kenttätesteissä. Luminesenssitekniikan etuja ovat sen herkkyys ja sen tarjoamat monipuoliset mittaustavat ja -parametrit. Luminesenssitekniikka perustuu luminoivan eli valoa säteilevän molekyylin käyttöön. Tyypillisesti luminoiva molekyyli toimii mitattavaan yhdisteeseen eli analyyttiin kiinnittyvänä leimamolekyylinä tai analyytille herkkänä indikaattorina. Sopivan mittausjärjestelyn avulla analyytin pitoisuusmuutokset voidaan havaita muutoksina mitatussa luminesenssiemissiossa, joko sen intensiteetissä, elinajassa, anisotropiassa, energiansiirrossa tai spektroskooppisissa ominaisuuksissa.

Mitattavat luminesenssimolekyylit sijaitsevat useimmiten jollakin rajapinnalla. Esimerkiksi tavallisessa fluoroimmunomäärityksessä leimatut vasta-ainemolekyylit sitoutuvat funktionalisoidulle mittauspinnalle, joka on usein läpinäkyvää dielektristä ainetta. Vastaavasti kemiallisessa anturoinnissa hyödynnetään usein järjestelyä, jossa analyytille herkät luminesenssi-indikaattorit sijaitsevat mittauspinnalla ohuen dielektrisen kalvon sisällä. Nämä dielektriset rajapinnat luovat optiseen taitekerroinavaruuteen epäjatkuvuuskohtia, jotka vaikuttavat merkittävästi sekä virittävän sähkökentän ominaisuuksiin että luminesenssiemission intensiteettiin ja avaruudelliseen säteilyjakaumaan rajapintojen lähellä. Sopivilla järjestelyillä näitä ilmiöitä voidaan hyödyntää luminesenssin mittaamisessa. Rajapintojen avulla sekä luminesenssin viritys että emission keräystekniikka voidaan tehdä pintaselektiivisesti. Tämä lisää merkittävästi pinnasta kerätyn luminesenssin intensiteettiä ja vaimentaa pinnan ulkopuolelta tulevia taustasignaaleja.

Pintaselektiivinen fluoresenssitekniikka soveltuu erinomaisesti nopeisiin immunomäärityksiin. Tekniikan avulla immunologisia sitoutumisreaktioita voidaan seurata reaaliaikaisesti, mikä mahdollistaa analyyttipitoisuuden ennustamisen jo testin varhaisessa vaiheessa. Erityisen hyvin tekniikka soveltuu pienten analyyttien, kuten steroidien, hormonien ja huumeiden pikadiagnostiikkaan haastavissa biologisissa näytematriiseissa. Tämän väitöskirjan keskeisen osan muodostaakin pintaselektiivisen mittausalustan kehittäminen nopean fluoroimmunomäärityksen tarpeisiin. Maksimaalisen pintaselektiivisyyden saavuttamiseksi kehitetyssä mittausalustassa hyödynnetään yhtä aikaa sekä sisäiseen kokonaisheijastukseen perustuvaa fluoresenssiviritystä (engl. total internal reflection, TIR) että ylikriittiseen kulman fluoresenssiin (engl. supercritical angle fluorescence, SAF) perustuvaa emission keräämistä. Mittausalustan keskeisenä komponenttina toimii mittatilaustyönä valmistettu paraboloidinen linssi, jonka avulla TIR ja SAF tekniikat voidaan yhdistää. Linssi on valmistettu polystyreenistä, jonka suhteellisen korkea taitekertoimen arvo parantaa SAF fluoresenssin keräystehokkuutta. Lisäksi näytealustana voidaan käyttää tavallisia polystyreenistä valmistettuja suorapohjaisia mikrokuoppalevyjä. Mittausalustan toiminta ja pintaselektiivisyys karakterisoidaan kokeellisesti, ja sen käyttöä tutkitaan kahden huumausaineen, morfiinin ja kokaiinin immunomäärityksessä.

Morfiinimääritys perustuu ei-kompetitiiviseen, kahta vasta-ainetta hyödyntävään immunomääritykseen. Merkkiaineilla leimattujen vasta-aineiden sitoutumista mittauspinnalle seurataan kehitetyllä mittausalustalla reaaliaikaisesti. Tulosten mukaan 30 sekunnin testissä voidaan määrittää morfiinipitoisuuksia, jotka ovat alle kymmenesosan viranomaisten morfiinille määrittämistä seulontarajoista (40 ng/mL). Kokaiinimääritys perustuu syrjäytys-tyyppiseen (engl. displacement-type) immunomääritykseen, jossa leimattujen vasta-aineiden irtoamista mittauspinnalta seurataan reaaliaikaisesti. Tulosten perusteella viranomaisten seulontarajoja vastaavien kokaiinipitoisuuksien (8 – 20 ng/mL) määrittäminen sylkinäytteistä on mahdollista 30 sekunnissa.

Toinen pintaselektiivistä luminesenssimenetelmistä hyötyvä sovellus on in vitro soluviljelmien kemiallinen anturointi. Tyypillisessä mittausjärjestelyssä analyytille herkät indikaattorimolekyylit on upotettu ohueen dielektriseen mittauskalvoon, joka on kiinnitetty soluviljelmän kasvatusalustaan. Pintaselektiivisten menetelmien käyttö tehostaa tällaista mittausta, sillä menetelmien avulla emissiovaloa saadaan kerättyä moninkertainen määrä verrattuna tavanomaisiin optisiin järjestelyihin. Tämä antaa mahdollisuuden käyttää alhaisempaa indikaattoripitoisuutta ja luminesenssin viritystehoa ja vähentää näin mittauksen invasiivisuutta ja solujen kokemaa häiriötä. Lisäksi pintaselektiivinen virityksessä solut eivät altistu suoralle viritysvalolle. Erityisesti herkkien, ihmisperäisistä kantasoluista johdettujen (engl. human induced pluripotent cell-derived, hiPSC-derived) solumallien yhteydessä nämä tekijät voivat olla merkittäviä.

Työssä kehitetään kaksi pintaselektiiviseen TIR ja SAF tekniikkaan perustuvaa happianturia in vitro soluviljelmien ja -mallien monitoroimiseen. Anturiratkaisujen lähtökohtana on minimoida niiden invasiivisuus ja toteuttaa optinen ratkaisu siten, että integroimien osaksi laajempaa solunkasvatusjärjestelmää on mahdollista. Molempien anturien keskeisenä optisena komponentti toimii mittatilaustyönä valmistetuttu paraboloidinen linssi. Kehitetyt happianturit karakterisoidaan, ja niitä käytetään ihmisperäisistä kantasoluista johdettujen sydänsolumallien happikonsentraation mittaamiseen yhdessä lämpötila- ja kaasunohjauksen, mikroelektrodi-matriisimittausten ja mikroskopian kanssa. Lopuksi työssä osoitetaan, että indikaattorien kovalenttinen kiinnittäminen mittauskalvoon parantaa ratkaisevasti mittauskalvon materiaalista bioyhteensopivuutta.

Luminescence is the most widely used technology in chemical and biochemical assays and sensor applications. It is used extensively in the fields of biotechnology, medical diagnostics, DNA sequencing, genetic research, forensic analysis as well as in various on-site diagnostic, screening and safety applications. Luminescence technology is attractive, since it provides high sensitivity, a wide variety of sensing schemes and several measurable parameters. The technology is based on the use of luminescent labels or indicator molecules, whose radiation in the detector is modulated by the analyte in terms of emission intensity, lifetime, anisotropy, energy transfer or spectroscopic properties.

Typically, the luminescent molecules to be detected are located at interfaces. There is a myriad of fluorescent immunoassays, where the fluorescently labelled biomolecules bind on transparent surfaces. Similarly, a typical sensing element a luminescence-based chemical sensor is composed of a thin dielectric layer embedded with analyte-sensitive indicators. In these common sensing geometries, the dielectric interfaces create discontinuities in the refractive index, which has substantial effects on the local electric field and the spatial radiation distribution of the adjacent molecular emitters. With appropriate optical arrangements, these effects can be exploited in the luminescence detection. Indeed, both the luminescence excitation and emission collection can be transformed into surface-selective or layer-selective modes, which significantly enhances the detected emission and suppresses the background signals.

The surface-selective fluorescence detection is an excellent technological choice for rapid fluorescent immunoassays. The technique gives highly sensitive means to monitor biochemical binding processes in real time and thus generate estimates for the analyte concentrations as soon as the assay begins. The technique is also relatively insensitive to many bulk matrix effects, which makes it especially well-suited for rapid on-site applications with challenging sample matrices, such as point-of-care diagnostics and rapid on-site screening of many small but important molecules, including steroids, hormones, toxins and abused drugs.

In this thesis, a fluorescent measurement platform with surface-selective techniques is developed for rapid immunoassays. For maximal surface-selectivity, the platform incorporates both the technique of total internal reflection excitation (TIR) and supercritical angle fluorescence (SAF). The key element of the platform is a parabolic lens, designed in the thesis and custom-manufactured from polystyrene, which facilitates the simultaneous application of TIR and SAF. The relatively high refractive index of polystyrene is advantageous in terms of the SAF collection efficiency and, in addition, polystyrene lens makes the platform compatible with standard flat-bottom microtiter plates. The thesis reports on the design, construction and characterization of the platform, as well as on its application to rapid immunoassays of two abused drug molecules: morphine and cocaine.

The morphine assay is based on a noncompetitive immunoassay utilizing two antibodies. The fluorescent detection antibodies bind on the sensing surface, which is monitored with the developed platform in real time. As a result, morphine concentrations below one tenth of the typical screening cutoff concentration of the authorities (40 ng/mL) can be detected in 30 sec. The cocaine assay is based on a displacement-type immunoassay. The developed platform makes it possible to follow the displacement process in real time. The results show that cocaine concentrations down to 10 ng/mL, comparable to the common cutoff values of the authorities (8 - 20 ng/mL), can be detected in untreated saliva samples in 30 sec.

Chemical sensing in in vitro cell cultures represents another key application for the surface-selective luminescence technology. In a widely applied chemical sensing geometry, analyte-specific indicators are embedded in an analyte-permeable thin film on the culturing substrate, and the analyte molecules modulate the luminescence properties of the indicator. To this geometry, the surface-selective (or layer-selective) detection techniques bring certain advantages, especially in terms of minimizing the invasiveness and the disruptions the cells experience. Firstly, compared to conventional luminescence collection set-ups, the surface-selective methods enhance the signal multiple times, thus allowing the use of low indicator concentrations and excitation power. Secondly, the surface-selective excitation protects the cells from a direct illumination. Especially in sensitive cell cultures, such as based on human induced pluripotent stem cell-derived (hiPSC-derived) cells, these features can be significant.

In the thesis, luminescence-based oxygen sensors with surface-selective TIR and SAF techniques are developed for in vitro cell cultures. The key factors in the designs are the minimal invasiveness and the integrability to the modular cell culture platform with numerous other functionalities, including temperature and gas control, microelectrode arrays and microscopy. The optical read-outs are based on custommanufactured parabolic lenses. The developed oxygen sensors are characterized and applied in experiments, where the functionality of hiPSC-derived cardiomyocytes is monitored under varying oxygen conditions. Finally, the thesis demonstrates how the luminescent sensing material itself can be made significantly more biocompatible by linking of the indicators covalently into the supporting matrix, that is, by preventing the leaching of the indicators.