Zebrafish as a Genetic Model to Study Tuberculosis
Harjula, Sanna-Kaisa (2020)
Harjula, Sanna-Kaisa
Tampere University
2020
Lääketieteen ja biotieteiden tohtoriohjelma - Doctoral Programme in Medicine and Life Sciences
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Väitöspäivä
2020-10-09
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-03-1589-4
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-03-1589-4
Tiivistelmä
Tuberkuloosi on yhä maailmanlaajuinen terveysongelma, sillä joka vuosi siihen sairastuu 10 miljoonaa ihmistä ja yli miljoona kuolee. Tuberkuloosin aiheuttaa Mycobacterium tuberculosis, joka leviää ilmateiden kautta. Tartunta voi johtaa erilaisiin tuloksiin oireettomasta latentista tilasta aktiiviseen tautiin. Koska tämänhetkiset hoitomuodot ovat riittämättömiä, taistelussa tuberkuloosia vastaan tarvitaan uusia lähestymistapoja. On näytetty, että isännän geneettinen tausta vaikuttaa M. tuberculosis-tartunnan lopputulokseen. Siksi seulomalla isännän geneettisten vaihteluiden vaikutusta mykobakteeri-infektion taudinkulkuun saadaan uutta tietoa, joka on hyödyllistä uusia hoitomuotoja kehitettäessä. Tuberkuloositutkimusta on hidastanut hyvien eläinmallien puute. Hyvä malli jäljittelisi tuberkuloosin taudinkulkua, mutta olisi silti sujuva käyttää ja huomioisi myös eettiset näkökohdat.
Seeprakala on kasvattanut suosiotaan immunologisena tutkimusmallina. On myös olemassa monenlaisia menetelmiä tuottaa seeprakalalle sekä satunnaisia että kohdennettuja mutaatioita. Seeprakalan luontainen taudinaiheuttaja, Mycobacterium marinum, on M. tuberculosis -bakteerin läheinen sukulainen. Se aiheuttaa seeprakalassa koko elimistöön vaikuttavan taudin. Erityisesti M. marinum -infektio seeprakalan poikasessa on vakiintunut tuberkuloosimalli. Väitöskirjatutkimuksessa selvitettiin aikuisen seeprakalan M. marinum -infektion käytettävyyttä tuberkuloosimallina. Tämän väitöskirjan ensimmäinen tavoite oli tutkia kyseisen infektion kulkua aikuisessa seeprakalassa histologisilla menetelmillä ja transkriptiotason tutkimuksella. Toinen tavoite oli tutkia interleukiini 10 (il10) -geenin tehtäviä M. marinum -infektion aikana. Lopullinen tavoite oli tehdä geneettinen seulonta ja tunnistaa isännän geenejä, joilla on tehtävä seeprakalan puolustautuessa mykobakteeri-infektiota vastaan.
Päästäksemme ensimmäiseen tavoitteeseemme värjäsimme M. marinum -bakteerin pitkittäisistä kudosleikkeistä, jotka oli otettu aikuisesta seeprakalasta infektion eri vaiheissa. Tutkimus osoitti, että infektoitaessa pienellä M. marinum -annoksella granuloomien ja infektoituneiden elinten lukumäärä vakiintui neljännestä viikosta eteenpäin. Suurella annoksella infektoitaessa infektoituneiden elinten lukumäärä oli korkeampi ja granuloomien lukumäärä kasvoi infektion edetessä. Selvittääksemme M. marinum -bakteerin aiheuttamaa immuunivastetta tarkemmin teimme koko genomin kattavan transkriptomianalyysin munuaisnäytteistä seeprakalan pääasiallinen verta muodostava elin). Tutkimus osoitti, että 14 päivää infektoinnin jälkeen synnynnäiseen immuunivasteeseen liittyvät prosessit olivat rikastuneet positiivisesti säädeltyjen geenien joukossa, kun taas rasva-aineenvaihduntaan liittyvät prosessit olivat rikastuneet negatiivisesti säädeltyjen geenien joukossa.
Käytimme il10e46 -mutanttiseeprakalalinjaa tutkiaksemme il10-geenin tehtäviä M. marinum infektion aikana seeprakalassa. Kyseisessä linjassa on mutaatio, joka aiheuttaa toimimattoman proteiinin syntymisen. Näytimme, että kyseisen mutaation suhteen homotsygootit kalat selvisivät villityypin kontrollikaloja paremmin M. marinum -infektion aikana ja kantoivat vähemmän bakteeria 8/9 viikon kuluttua pienellä bakteeriannoksella infektoimisesta. Nämä tulokset viittaavat parantuneeseen vastustuskykyyn M. marinum -bakteeria vastaan. il10e46/e46-mutanteilla tnfb ja il1b tulehdussytokiinien ilmentyminen oli lisäksi vähentynyt mahdollisesti kuvastaen infektion hitaampaa etenemistä. interferoni gamma 1 -geenin ilmentyminen oli lisääntynyt ja T-auttajasolu 1 (Th1) -vaste vahvistunut il10e46/e46-mutanteilla mahdollisesti selittäen parantuneen vastustuskyvyn.
Suoritimme geneettisen seulonnan tunnistaaksemme geenejä, joilla on merkitystä aikuisen seeprakalan puolustautuessa mykobakteeri-infektiota vastaan. Tunnistimme
10 mutanttiseeprakalalinjaa, jotka selviytyivät huonommin ja yhden linjan, joka selviytyi paremmin pienen M. marinum -bakteeriannoksen aiheuttaman infektion aikana. Herkin linja, jonka tunnistimme, mutant463, kantoi 14 päivää infektoinnin jälkeen merkittävästi enemmän bakteeria verrattuna villityypin kaloihin. Tämä viittaa ennemmin heikentyneeseen vastustuskykyyn kuin heikentyneeseen sietokykyyn M. marinum -bakteeria kohtaan. Teimme myös mutant463-linjalle transkriptomianalyysin. Tulokset osoittivat, että mutant463-seeprakaloilla oli 27 geenin ilmentyminen heikentynyt munuaissoluissa villityypin kaloihin verrattuna 14 päivää infektoinnin jälkeen. Näiden geenien joukossa on seitsemän geeniä, joilla on tunnettu tai ennustettu immunologinen tehtävä.
Ensimmäisessä osatyössä näytimme, että seeprakalan M. marinum -infektion histologiset piirteet muistuttavat tuberkuloosin piirteitä. Toisen osatyön tulokset il10- geenin tehtävistä sopivat yhteen aiemman kirjallisuuden kanssa, sillä ne korostavat Th1-vasteen osuutta vastustuskyvyssä mykobakteeria kohtaan. Nämä tulokset vahvistavat käyttämäämme tuberkuloosimallia. Lisäksi kolmannessa osatyössä tunnistimme geenejä, joilla on mahdollisesti tehtävä immuunipuolustuksessa mykobakteeri-infektiota vastaan. Näiden geenien tehtävien varmentamiseksi ja
tarkentamiseksi on tarpeen tehdä lisätutkimuksia.
Seeprakala on kasvattanut suosiotaan immunologisena tutkimusmallina. On myös olemassa monenlaisia menetelmiä tuottaa seeprakalalle sekä satunnaisia että kohdennettuja mutaatioita. Seeprakalan luontainen taudinaiheuttaja, Mycobacterium marinum, on M. tuberculosis -bakteerin läheinen sukulainen. Se aiheuttaa seeprakalassa koko elimistöön vaikuttavan taudin. Erityisesti M. marinum -infektio seeprakalan poikasessa on vakiintunut tuberkuloosimalli. Väitöskirjatutkimuksessa selvitettiin aikuisen seeprakalan M. marinum -infektion käytettävyyttä tuberkuloosimallina. Tämän väitöskirjan ensimmäinen tavoite oli tutkia kyseisen infektion kulkua aikuisessa seeprakalassa histologisilla menetelmillä ja transkriptiotason tutkimuksella. Toinen tavoite oli tutkia interleukiini 10 (il10) -geenin tehtäviä M. marinum -infektion aikana. Lopullinen tavoite oli tehdä geneettinen seulonta ja tunnistaa isännän geenejä, joilla on tehtävä seeprakalan puolustautuessa mykobakteeri-infektiota vastaan.
Päästäksemme ensimmäiseen tavoitteeseemme värjäsimme M. marinum -bakteerin pitkittäisistä kudosleikkeistä, jotka oli otettu aikuisesta seeprakalasta infektion eri vaiheissa. Tutkimus osoitti, että infektoitaessa pienellä M. marinum -annoksella granuloomien ja infektoituneiden elinten lukumäärä vakiintui neljännestä viikosta eteenpäin. Suurella annoksella infektoitaessa infektoituneiden elinten lukumäärä oli korkeampi ja granuloomien lukumäärä kasvoi infektion edetessä. Selvittääksemme M. marinum -bakteerin aiheuttamaa immuunivastetta tarkemmin teimme koko genomin kattavan transkriptomianalyysin munuaisnäytteistä seeprakalan pääasiallinen verta muodostava elin). Tutkimus osoitti, että 14 päivää infektoinnin jälkeen synnynnäiseen immuunivasteeseen liittyvät prosessit olivat rikastuneet positiivisesti säädeltyjen geenien joukossa, kun taas rasva-aineenvaihduntaan liittyvät prosessit olivat rikastuneet negatiivisesti säädeltyjen geenien joukossa.
Käytimme il10e46 -mutanttiseeprakalalinjaa tutkiaksemme il10-geenin tehtäviä M. marinum infektion aikana seeprakalassa. Kyseisessä linjassa on mutaatio, joka aiheuttaa toimimattoman proteiinin syntymisen. Näytimme, että kyseisen mutaation suhteen homotsygootit kalat selvisivät villityypin kontrollikaloja paremmin M. marinum -infektion aikana ja kantoivat vähemmän bakteeria 8/9 viikon kuluttua pienellä bakteeriannoksella infektoimisesta. Nämä tulokset viittaavat parantuneeseen vastustuskykyyn M. marinum -bakteeria vastaan. il10e46/e46-mutanteilla tnfb ja il1b tulehdussytokiinien ilmentyminen oli lisäksi vähentynyt mahdollisesti kuvastaen infektion hitaampaa etenemistä. interferoni gamma 1 -geenin ilmentyminen oli lisääntynyt ja T-auttajasolu 1 (Th1) -vaste vahvistunut il10e46/e46-mutanteilla mahdollisesti selittäen parantuneen vastustuskyvyn.
Suoritimme geneettisen seulonnan tunnistaaksemme geenejä, joilla on merkitystä aikuisen seeprakalan puolustautuessa mykobakteeri-infektiota vastaan. Tunnistimme
10 mutanttiseeprakalalinjaa, jotka selviytyivät huonommin ja yhden linjan, joka selviytyi paremmin pienen M. marinum -bakteeriannoksen aiheuttaman infektion aikana. Herkin linja, jonka tunnistimme, mutant463, kantoi 14 päivää infektoinnin jälkeen merkittävästi enemmän bakteeria verrattuna villityypin kaloihin. Tämä viittaa ennemmin heikentyneeseen vastustuskykyyn kuin heikentyneeseen sietokykyyn M. marinum -bakteeria kohtaan. Teimme myös mutant463-linjalle transkriptomianalyysin. Tulokset osoittivat, että mutant463-seeprakaloilla oli 27 geenin ilmentyminen heikentynyt munuaissoluissa villityypin kaloihin verrattuna 14 päivää infektoinnin jälkeen. Näiden geenien joukossa on seitsemän geeniä, joilla on tunnettu tai ennustettu immunologinen tehtävä.
Ensimmäisessä osatyössä näytimme, että seeprakalan M. marinum -infektion histologiset piirteet muistuttavat tuberkuloosin piirteitä. Toisen osatyön tulokset il10- geenin tehtävistä sopivat yhteen aiemman kirjallisuuden kanssa, sillä ne korostavat Th1-vasteen osuutta vastustuskyvyssä mykobakteeria kohtaan. Nämä tulokset vahvistavat käyttämäämme tuberkuloosimallia. Lisäksi kolmannessa osatyössä tunnistimme geenejä, joilla on mahdollisesti tehtävä immuunipuolustuksessa mykobakteeri-infektiota vastaan. Näiden geenien tehtävien varmentamiseksi ja
tarkentamiseksi on tarpeen tehdä lisätutkimuksia.
Kokoelmat
- Väitöskirjat [4945]