Ribavirin and pleconaril as a combination therapy against coxsackievirus B 1-6 infections in vitro
Savonen, Tarja (2020)
2020
Bioteknologian ja biolääketieteen tekniikan maisteriohjelma - Degree Programme in Biotechnology and Biomedical Engineering, MSc
Lääketieteen ja terveysteknologian tiedekunta - Faculty of Medicine and Health Technology
This publication is copyrighted. Only for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Hyväksymispäivämäärä
2020-05-12
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202004294741
https://urn.fi/URN:NBN:fi:tuni-202004294741
Tiivistelmä
Coxsackie B virukset (CVB1-6) kuuluvat enterovirusten sukuun ja Picornaviridae-heimoon. Ne aiheuttavat laajan kirjon erilaisia tauteja, sillä ne voivat aiheuttaa infektion haimassa, sydämessä tai keskushermostossa. Ne ovat myös linkitetty joihinkin kroonisiin sairauksiin sekä autoimmuunireaktioihin, kuten tyypin 1 diabetekseen. CVB1-6 infektioita vastaan ei ole vielä lääkettä, sillä monet potentiaaliset lääkkeet eivät ole läpäisseet kliinisen tutkimuksen seulaa. Rokote niitä vastaan on tosin kehitteillä, ja sen oletetaan tulevaisuudessa estävän osuutta tyypin 1 diabetes tapauksista, samalla todistaen virusten ja tyypin 1 diabeteksen välisen kausaliteetin. Tämän tutkimuksen tavoitteena on löytää potentiaalinen viruslääkehoito käytettäväksi tyypin 1 diabetesta hoitaviin kliinisiin tutkimuksiin. Yhdistelmäterapia voisi toimia tehokkaammin samalla estäen lääkeresistenssin syntymistä. Lisäksi synergisen viruslääkeparin löytäminen johtaisi mahdollisesti pienempiin annosmääriin ja madaltuneisiin sivuvaikutuksiin, jotka tällä hetkellä estävät lääkkeiden kliinisen käytön.
Tutkimusmenetelmät:
Tutkimus suoritettiin in vitro mallilla hyödyntäen A549 solulinjaa. Ensin solujen elävyyden mittaaminen, sopivat konsentraatiot viruksille (CVB1-6) ja viruslääkkeille (ribavirin ja pleconaril) optimoitiin. Viruslääkkeiden sytotoksisuutta arvioitiin kolorimetrisellä (MTT) mittauksella. Viruslääkkeitä testatessa virusten konsentraatiot pidettiin vakiona, kun taas lääkkeiden konsentraatiot vaihtelivat, johtaen vaihteluväliin täydestä infektiosta koko infektion inhibitioon. Yhdistelmäterapiassa nämä vaihtelevat lääkekonsentraatiot yhdistettiin. Solujen vitaliteetti määritettiin fixoimalla ja värjäämällä elävät solut crystal violetilla ja mittaamalla liuotetun väriaineen absorbanssi. Lääkeaineiden synergistä vaikutusta arvioitiin mittaustulosten perusteella Bliss:in malliin pohjautuvalla Mac Synergy II Excel taulukolla.
Tutkimustulokset:
Ribavirin ja pleconaril yhdistelmäterapiana ei johtanut mainittavaan synergiaan. Tulokset viittaavat tämän viruslääkeparin toimivan yhdessä ennemminkin additiivisella tasolla tai jopa antagonisesti, riippuen käytetyistä konsentraatiosta.
Johtopäätelmät:
CVB infektioita vastaan ei edelleenkään löydy toimivaa parannusta, siispä kaikkia mahdollisia parannuskeinoja on tutkittava. Ribavirinin ja pleconarilin yhdistelmä saattaisi yltää additiivisen vaikutuksen kategoriaan CVB1-6 viruksia vastaan. Tällöin yhdistelmästä voisi olla silti hyötyä, sillä yhdistelmänä ne edelleen vastustaisivat virusten lääkeresistenssiä paremmin kuin mikään yksittäinen lääke. Tämä lääkepari valittiin tutkimukseen useista aiemmin testatuista pareista, sillä se oli todettu kaikista potentiaalisimmaksi yhdistelmäksi. Olemme tietoisia siitä, että tutkimuksessa käytetyt virukset olivat soluviljelylle mukautettuja kantoja. Tutkimustulosten täydennys luonnosta eristetyillä kannoilla olisi sen vuoksi tarpeellista. Background and aims:
Coxsackie B viruses (CVB1-6) belong to enterovirus genus within the family Picornaviridae and are the cause of wide range of diseases as they can infect pancreas, heart, and central nervous system. They are also linked to some chronic diseases and autoimmunity, most interestingly to type 1 diabetes. Currently no antiviral has been licenced specifically to treat EVs, as many antiviral drugs have failed to reach the clinical use. On the other hand, a multivalent CVB vaccine is currently being developed, which is hypothesised to prevent a portion of type 1 diabetes cases helping to show the causality link between the virus and the condition. The aim of this study is to find potential antiviral treatments to be used in type 1 diabetes treatment trials. Combining drugs might be more efficient also reducing the probability of drug resistance. Subsequently, finding a synergic drug combination would lead to reduce the effective doses and prevent adverse effects of the drugs which currently obstruct their clinical usage.
Methods:
The study was done in vitro, using human lung fibroblast cells, A549. First, the colorimetric cell viability measurement via crystal violet, the concentrations of viruses (CVB1-6), and the doses of antiviral drugs ribavirin and pleconaril were optimized. The cytotoxicity of these drugs was analysed by MTT colorimetric cell viability measurement. For antiviral treatments the optimized virus titers were kept constant while drug concentrations ranged to exhibit complete inhibition of infection to the complete cytopathic effect caused by the viruses. The drugs were then used in a mixture as a matrix for a combination treatment to be assessed. The cell viabilities were quantified by solubilizing crystal violet stain from the fixed-stained viable cells and measuring the colorimetric absorbances for each experimental unit in multiplicate. The quantified cell viabilities were analysed by Mac Synergy II excel spreadsheet evaluating the synergic effect of the two drugs by Bliss model.
Results:
The combination treatments with ribavirin and pleconaril did not show a great amount of synergy. The results show that the combination works rather on the additive level or even having antagonism depending on concentrations.
Conclusion:
As CVBs still lack an effective cure, all rocks must be turned in search of it. The combination of ribavirin and pleconaril might offer only a limited option, but at the same time might offer a viable treatment to reduce the occurrence of resistant mutants of the virus. This antiviral drug combination was selected from many other drug combinations that we have been testing for a closer look in this thesis, as it has been acknowledged to be a promising combination against CVBs. We must acknowledge that the strains of the virus used in this study were cell culture adapted strains and further studies using field isolated with limited passage history is needed.
Tutkimusmenetelmät:
Tutkimus suoritettiin in vitro mallilla hyödyntäen A549 solulinjaa. Ensin solujen elävyyden mittaaminen, sopivat konsentraatiot viruksille (CVB1-6) ja viruslääkkeille (ribavirin ja pleconaril) optimoitiin. Viruslääkkeiden sytotoksisuutta arvioitiin kolorimetrisellä (MTT) mittauksella. Viruslääkkeitä testatessa virusten konsentraatiot pidettiin vakiona, kun taas lääkkeiden konsentraatiot vaihtelivat, johtaen vaihteluväliin täydestä infektiosta koko infektion inhibitioon. Yhdistelmäterapiassa nämä vaihtelevat lääkekonsentraatiot yhdistettiin. Solujen vitaliteetti määritettiin fixoimalla ja värjäämällä elävät solut crystal violetilla ja mittaamalla liuotetun väriaineen absorbanssi. Lääkeaineiden synergistä vaikutusta arvioitiin mittaustulosten perusteella Bliss:in malliin pohjautuvalla Mac Synergy II Excel taulukolla.
Tutkimustulokset:
Ribavirin ja pleconaril yhdistelmäterapiana ei johtanut mainittavaan synergiaan. Tulokset viittaavat tämän viruslääkeparin toimivan yhdessä ennemminkin additiivisella tasolla tai jopa antagonisesti, riippuen käytetyistä konsentraatiosta.
Johtopäätelmät:
CVB infektioita vastaan ei edelleenkään löydy toimivaa parannusta, siispä kaikkia mahdollisia parannuskeinoja on tutkittava. Ribavirinin ja pleconarilin yhdistelmä saattaisi yltää additiivisen vaikutuksen kategoriaan CVB1-6 viruksia vastaan. Tällöin yhdistelmästä voisi olla silti hyötyä, sillä yhdistelmänä ne edelleen vastustaisivat virusten lääkeresistenssiä paremmin kuin mikään yksittäinen lääke. Tämä lääkepari valittiin tutkimukseen useista aiemmin testatuista pareista, sillä se oli todettu kaikista potentiaalisimmaksi yhdistelmäksi. Olemme tietoisia siitä, että tutkimuksessa käytetyt virukset olivat soluviljelylle mukautettuja kantoja. Tutkimustulosten täydennys luonnosta eristetyillä kannoilla olisi sen vuoksi tarpeellista.
Coxsackie B viruses (CVB1-6) belong to enterovirus genus within the family Picornaviridae and are the cause of wide range of diseases as they can infect pancreas, heart, and central nervous system. They are also linked to some chronic diseases and autoimmunity, most interestingly to type 1 diabetes. Currently no antiviral has been licenced specifically to treat EVs, as many antiviral drugs have failed to reach the clinical use. On the other hand, a multivalent CVB vaccine is currently being developed, which is hypothesised to prevent a portion of type 1 diabetes cases helping to show the causality link between the virus and the condition. The aim of this study is to find potential antiviral treatments to be used in type 1 diabetes treatment trials. Combining drugs might be more efficient also reducing the probability of drug resistance. Subsequently, finding a synergic drug combination would lead to reduce the effective doses and prevent adverse effects of the drugs which currently obstruct their clinical usage.
Methods:
The study was done in vitro, using human lung fibroblast cells, A549. First, the colorimetric cell viability measurement via crystal violet, the concentrations of viruses (CVB1-6), and the doses of antiviral drugs ribavirin and pleconaril were optimized. The cytotoxicity of these drugs was analysed by MTT colorimetric cell viability measurement. For antiviral treatments the optimized virus titers were kept constant while drug concentrations ranged to exhibit complete inhibition of infection to the complete cytopathic effect caused by the viruses. The drugs were then used in a mixture as a matrix for a combination treatment to be assessed. The cell viabilities were quantified by solubilizing crystal violet stain from the fixed-stained viable cells and measuring the colorimetric absorbances for each experimental unit in multiplicate. The quantified cell viabilities were analysed by Mac Synergy II excel spreadsheet evaluating the synergic effect of the two drugs by Bliss model.
Results:
The combination treatments with ribavirin and pleconaril did not show a great amount of synergy. The results show that the combination works rather on the additive level or even having antagonism depending on concentrations.
Conclusion:
As CVBs still lack an effective cure, all rocks must be turned in search of it. The combination of ribavirin and pleconaril might offer only a limited option, but at the same time might offer a viable treatment to reduce the occurrence of resistant mutants of the virus. This antiviral drug combination was selected from many other drug combinations that we have been testing for a closer look in this thesis, as it has been acknowledged to be a promising combination against CVBs. We must acknowledge that the strains of the virus used in this study were cell culture adapted strains and further studies using field isolated with limited passage history is needed.