Leimattujen solunulkoisten vesikkelien puhdistuksen optimointi - Optimizing the Purification of Fluorescently Labeled Extracellular Vesicles

Abstract

Perinteiset lääkkeenkantajat ovat laajalti käytettyjä, mutta usein puutteellisia toiminnaltaan. Solunulkoiset vesikkelit (EV) ovat uuden sukupolven ratkaisu perinteisten lääkkeenkantajien korvaajiksi, sillä ne ovat luontaisesti soluohjautuvia ja stabiileja verenkierrossa. EV:iden tutkimusala on kuitenkin hyvin nuori, ja lupaavuudestaan huolimatta EV:iden käyttö lääkkeenkantajina vaatii vielä lisää tutkimusta. Tampereen yliopistolla keskitytään EV:iden kulkeutumiseen soluissa, mitä voidaan tutkia fluoresenssimikroskopian alalajin, elinaikaerotteisen fluoresenssimikroskopian (FLIM), avulla. Jotta EV:t saataisiin näkyviin FLIM:llä, tai fluoresenssiin perustuvilla menetelmillä ylipäätään, täytyy EV:t leimata fluoresoivilla väriaineilla eli fluoroforeilla. EV:iden leimaaminen ei kuitenkaan ole täydellinen prosessi, ja leimauksen yhteydessä osa väriaineesta jää kiinnittymättä EV:isiin. Koska tämä vapaa väriaine häiritsee FLIM-mittauksia, täytyy leimatut EV:t puhdistaa. Leimattujen EV:iden puhdistamiseen ei kuitenkaan ole olemassa selkeitä yleisesti käytettyjä menetelmiä, ja puhdistus riippuu hyvinkin paljon käytetystä väriaineesta. Tässä työssä tarkasteltiin kahdella väriaineella, BODIPY-fenyyli-C12:lla (BPC12) ja Tubulin Tracker -väriaineella (Ptx-OG), leimattujen EV:iden puhdistamista neljällä eri menetelmällä: ultrasuodatuksella kahdella eri kalvon huokoskoolla (10 kDa ja 100 kDa), ultrasentrifugoinnilla ja ultrasentrifugoinnilla tiheysgradientissa. Ultrasuodatuksen erotuskyky perustuu partikkelien kokoon, ultrasentrifugointi sedimentaationopeuteen ja tiheysgradientti nosteeseen ja tiheyteen. Vapaan väriaineen poistumista EV-suspensiosta, sekä EV:iden leimaustehokkuutta tutkittiin fluoresenssispektroskopian avulla, ja puhdistettujen leimattujen EV:iden saanto määritettiin nanopartikkelien seuranta-analyysillä (NTA). Tulosten perusteella BPC12-väriaineelle parhaiten sopiva menetelmä vaikuttaisi olevan ultrasuodatus 10 kDa:n kalvolla ja Ptx-OG:lle ultrasentrifugointi tiheysgradientissa vaikuttaisi lupaavimmalta puhdistusmenetelmältä. Ultrasuodatus ei erottanut vapaata Ptx-OG:ta EV-suspensiosta käytännössä lainkaan kummallakaan kalvolla, ja 100 kDa:n kalvo antoi jonkin verran 10 kDA:n kalvoa huonomman EV-saannon BPC12-väriaineella. Ultrasentrifugointi tuotti NTA:n mukaa suuret saannot, mutta tämä johtuu todennäköisemmin aggregoitumisesta tai EV:iden hajoamisesta, kuin todellisesta EV:iden puhdistumisesta. Tiheysgradienttipuhdistus ei toiminut BPC12-leimatuille EV:ille, mutta vapaan Ptx-OG:n kontrollinäytteellä puhdistus vaikutti toimivalta. Kuitenkin, koska tiheysgradienttipuhdistusta ei kokeiltu Ptx-OG-leimatuilla EV:illä, tietoa EV:iden saannoista tai leimaustehokkuuksista ei saatu. Sen lisäksi, että tässä työssä selvitettiin rajatusti kahdelle väriaineille sopivaa EV:iden puhdistusmenetelmää, muodostettiin myös ohjeistus siitä, miten on mahdollista optimoida muilla väriaineilla leimattujen EV:iden puhdistus tässä työssä tutkituilla menetelmillä. Tämä tieto helpottaa erityisesti Tampereen yliopistolla tehtävän EV-tutkimuksen etenemistä, sekä kannustaa leimattujen EV:iden puhdistuksen tarkempaan dokumentointiin.