Utilizing Nordic Forest Plant and Fungi Extracts: Bioactivity assessment with bacterial whole-cell biosensors

Abstract

Luonnonmateriaalien sisältämien biologisesti aktiivisten komponenttien seulontaan tarvitaan uusia tehokkaita menetelmiä. Tässä tutkimuksessa metsästä saatavien uutteiden bioaktiivisuuden määrittämiseen käytettiin kokosolubiosensoreita. Tätä vaihtoehtoista seulontamenetelmää on tutkittu tarkoituksessa vain vähän, mutta herkkyytensä vuoksi se on varteenotettava. Tutkimuksessa aktiivisuushavaintoja täydentämään käytettiin myös perinteisempiä menetelmiä kuten antioksidanttikuoppalevytestejä. Lisäksi aineenvaihduntatuotteet määritettiin bioaktiivisiksi havaituista endofyyttisieniuutteista nestekromatografia-massaspektrometriaa (LC-MS) käyttäen.

Tutkimuksen osana kehitettiin kaksi biosensorimenetelmää Escherichia coli kokosolubiosensoreille. Ensimmäinen sovellus parantaa aiemmin kuvattua antioksidanttisuuden mittaamisen menetelmää sen seulonnan tehopotentiaalia lisäämällä. Toinen esittelee menetelmän UV-säteilysuojan mittaamiseksi määrittäen sekä biologista että absorbanssipohjaista suojauskykyä. Menetelmällä voidaan saada samalla tietoa myös näytteen genotoksisuudesta. Kehitettyjen menetelmien toimivuus vahvistettiin malliyhdisteitä käyttäen, ja ne todettiin toimiviksi myös luonnonaineuutteilla joillakin rajoituksilla. Bakteeribiosensoreita voidaan käyttää etenkin konsentraatioltaan pienien näytteiden ja fraktioiden aktiivisuus- tai inaktiivisuusseulonnoissa, jolloin minimoidaan rajoitukset, kuten näytematriisin signaalin peittovaikutus ja induktioviive.

Endofyyttisienet elävät kasvien sisällä aiheuttamatta oireilua isäntäkasvissa, ja ne voivat lisätä esimerkiksi isäntien kasvua ja stressinsietokykyä. Endofyyttisienet sisältävät suuren määrän toistaiseksi hyödyntämättömiä bioaktiivisia yhdisteitä, joita voidaan käyttää erilaisiin tarkoituksiin. Tutkimuksessa männyn taimien juurista eristettiin Acephala applanata, Philocephala fortinii ja Humicolopsis cephalosporioides/ Coniochaeta mutabilis -endofyyttisienilajit, ja niistä löydettiin suuri määrä yhdisteitä LC-MS: lla (yht. 318 kpl). Yhdisteistä tunnistettiin eri varmuusasteilla 220 kpl. Sienilajien uutteiden ja fraktioiden antioksidantti- ja antibakteerisuuspotentiaali seulottiin käyttäen E. coli -biosensorimenetelmiä sekä täydentäviä menetelmiä ja havaittiin useita aktiivisuuksia.

Johtopäätöksenä endofyyttisienet sisältävät valtavan määrän mahdollisesti toiminnallisia aineenvaihduntatuotteita, ja kokosolubiosensorimenetelmät soveltuvat erilaisten luontopohjaisten näytteiden tutkimiseen antaen samanaikaisesti tietoa sekä näytteen bioaktiivisuudesta että biosaatavuudesta, mikäli myös niiden heikkoudet huomioidaan mittausasettelussa.

Efficient methods are needed in the search for novel biologically active components from natural sources. Bacterial whole-cell biosensors offer a less-examined alternative with high sensitivity. In this thesis, forest-derived extracts were screened for their bioactivity with bacterial whole-cell biosensors and complementary measures, such as antioxidant microplate tests. The main metabolites were also identified from endophytic fungi extracts using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).

Two novel applications of biosensors are described for Escherichia coli whole-cell biosensors. The first application provides an improved antioxidant method via increased high-throughput screening potential and the other describes a method for measuring the UV protection capacity for both the biological and absorbance-based shield. There is also an opportunity to obtain simultaneous information of the genotoxicity of the sample. The methodologies were validated using reference compounds and were found to be usable in the field of forest-derived extracts with certain limitations. The bacterial biosensors were used in an activity/inactivity type of screening. By using small concentrations of forest-derived extracts or fractionated samples, the limitations, such as possible sample matrix masking effect and induction delay phenomenon, can be reduced.

Endophytic fungi live asymptomatically inside a plant host and are often beneficial for the host plant growth and stress resistance. They comprise a large untapped source of potential bioactive compounds to be utilized for different purposes. Many metabolites (318) were discovered using an LC-MS methodology from Acephala applanata, Phialocephala fortinii and Humicolopsis cephalosporioides/ Coniochaeta mutabilis isolated from the roots of Scots pine seedlings. Out of the metabolites, 220 were identified with varying degree of certainty. The antioxidant and antimicrobial potential of the extracts and fractions were screened with the biosensors and complementary methods and various bioactivities were discovered.

In conclusion, endophytic fungi are a rich source of potential functional metabolites and whole-cell biosensor methodologies are usable for nature-based samples and provide valuable insights into both the bioactivity and bioavailability of the material, if their limitations are also considered.