Genome-wide Transcriptional Characterization of the ETV6-RUNX1-positive Childhood Leukemia

Abstract

Akuutti lymfoblastileukemia (ALL) on lasten yleisin syöpä. Useimmiten se saa alkunsa epäkypsästä B-solusta (preB), jossa tapahtuu tietty altistava geneettinen muutos. Yksi yleisimmistä muutoksista on translokaatio, joka johtaa ETV6-RUNX1 (E/R) fuusiogeenin syntymiseen. Leukemian puhkeamiseen vaaditaan lisäksi muita geneettisiä muutoksia, jotka usein osuvat B-solun identiteetille tärkeisiin geeneihin. DNA-vaurioiden lisäksi solun toiminta voi häiriintyä RNA-molekyylien ja proteiinien toiminnan muutoksista. E/R on epänormaali transkriptiotekijä ja sen suorat säätelykohteet ovat vielä jääneet epäselviksi.

Tässä työssä tutkimme lasten prekursori B-ALL:ssa (preB-ALL) tapahtuvaa genominlaajuista geeniensäätelyä tarkastelemalla varhaista RNA-transkriptiota solulinjoissa ja potilasnäytteissä. E/R-fuusion kohdegeenien kartoittamista varten teimme solulinjamallin, jossa fuusion tuotantoa voidaan säädellä. Määritimme tehostaja-alueet tehostaja-RNA:iden (eRNA) ilmentymisen perusteella sekä niiden mahdolliset kohdegeenit perustuen signaalimuutosten samankaltaisuuteen. E/R- fuusion säätelemistä geeneistä kaksi kolmasosaa hiljeni suoran RUNX1-välitteisen DNA-sitoutumisen kautta. Lisäksi E/R vähensi B-solu-spesifisten tehostaja- alueiden luentaa. Osa geeneistä myös ilmentyi eri tavalla E/R-potilaiden leukemiasoluissa verrattuna muiden preB-ALL alityyppien potilaiden soluihin.

RAG ja AID entsyymit on liitetty DNA-katkosten syntymiseen B-solu- leukemiassa ja niiden toimintaan tiedetään liittyvän avoimena oleva kromatiini. Tutkimme RNA-transkriptiota B-linjan soluissa keskittyen lasten leukemiassa usein nähtäviin DNA-katkoskohtiin. Huomasimme, että katkoskohtiin assosioituvat tietyt transkriptionaaliset ominaisuudet: RNA-polymeraasin pysähtyminen sekä yhtäaikainen geenienluenta päällekkäisiltä DNA-juosteilta. Nämä piirteet näyttävät altistavan DNA:n katkoksille erityisesti paljastamalla RAG-entsyymin rekombinaatiosignaalisekvenssejä. Huomasimme myös korkean RAG1-geenin luennan erityisesti E/R-potilailla sekä AID-entsyymiä koodaavan geenin epätavallisen luennan osalla korkean riskin preB-ALL potilaita.

Tässä väitöskirjassa tunnistettiin E/R-fuusion genominlaajuisia säätelykohteita sekä toistuvien DNA-katkosten kohdille ominaisia transkriptionaalisia piirteitä lasten leukemiassa.

Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common cancer affecting in childhood. It occurs typically in early B-lineage cells and is characterized by a few specific initiating genomic alterations. One of the most common alterations is the translocation resulting in the ETV6-RUNX1 (E/R) fusion gene. Progression to overt ALL requires additional genetic abnormalities that are recurrently found at essential B-cell lineage identity determining genes. Besides DNA, alterations in various RNA species and proteins could also have marked unwanted effects on cell behavior. E/R functions as an aberrant transcription factor but its direct target genes have thus far remained uncertain.

We set out to study genome-wide gene regulation in childhood precursor B-ALL (preB-ALL) by studying nascent RNA transcription in cell lines and patient samples. For the examination of target sites, we generated a cell line model with an inducible E/R. We detected enhancer regions by the expression of eRNA transcripts and deciphered a possible target gene by correlating between expression level changes. Two thirds of the E/R-regulated genes were repressed by direct regulation via RUNX1 DNA binding. We further showed E/R-mediated downregulation of B-cell specific super-enhancers. Some of the regulated genes were observed to be differentially expressed among E/R patients when compared to other preB-ALL patients.

RAG and AID are enzymes that have been linked to the genesis of secondary genetic alterations in B-cell leukemia. We explored the nascent RNA transcription across B-lymphoid cells at the genomic sites that are often deleted in childhood precursor B-ALL and noticed significant association with specific transcriptional features, namely RNA polymerase II stalling and convergent transcription. These features seem to expose the DNA to double strand breaks especially by revealing RAG recombination signal sequences. We noticed high RAG1 expression in the E/R subtype, and abnormal expression of AICDA among the non-classified precursor B-ALL cases.

This thesis identifies genome-wide targets of the E/R fusion and specific transcriptional features that are associated with recurrent DNA breakpoint sites in childhood precursor B-ALL.