Building Neural in vitro Models with Human Pluripotent Stem Cells : Neuronal Functionality and the Role of Astrocytes in the Networks

Abstract

Ymmärryksemme ihmisaivojen kehityksestä ja toiminnasta on edelleen puutteellista. Valitettavasti neurotieteiden alalta puuttuu edustavia ihmisspesifisiä malleja, jotka täydentäisivät eläinmalleilla tehtäviä tutkimuksia. Ihmisaivokudoksen saatavuus tutkimustarkoituksiin on rajoitettua, mikä kannustaa uusien lähestymistapojen, kuten ihmisen monikykyisistä kantasoluista johdettujen hermosolujen hyödyntämistä. Muutaman viime vuosikymmenen aikana ihmisen monikykyisiin kantasoluihin liittyvä tutkimusala on laajentunut valtavasti. Kasvavat odotukset kohdistuvat kantasolujen ja niiden johdannaisten soveltamiseen regeneratiivisessa lääketieteessä, lääkkeiden seulonnassa ja tautien mallinnuksessa.

Tämän tutkimuksen pääpainona oli arvioida ihmisen monikykyisistä kantasoluista johdettujen hermosoluviljelmien potentiaalia jäljitellä tiettyjä keskushermoston kehityksen ja toiminnallisuuden tunnusmerkkejä. Tulosten on tarkoitus auttaa validoimaan kantasolumallien hyödyllisyys soveltavan neurotieteen käyttötarkoituksissa. Tätä varten verrattiin kahdella yleisesti käytetyllä erilaistusmenetelmällä tuotettujen ihmisen monikykyisistä kantasoluista johdettujen hermosolujen erilaistumiskykyä. Hermosolujen toiminnallista kypsymistä arvioitiin sekä pidennetyn erilaistusajan jälkeen, että viljelyolosuhteiden optimoinnin seurauksena verkostotason analyyseillä. Tuloksia täydennettiin vertailemalla näiden verkostojen toiminnallisuutta laajalti käytettyyn jyrsijäperäiseen solumalliin. Koska astrosyytit ovat hermosoluja ympäröiviä soluja ja ne tukevat keskushermoston toiminnallisuutta, erityistä huomiota kiinnitettiin myös astrosyyttien rooliin sekä normaaleissa että tulehduksellisissa olosuhteissa, joista jälkimmäinen on tyypillinen tila keskushermoston vaurioissa.

Tämän väitöskirjan tulokset viittaavat siihen, että ihmisen monikykyisistä kantasoluista johdetut hermosoluviljelmät toistavat useita in vivo olosuhteissa tapahtuvia keskushermoston kehityksen vaiheita. Erityinen kemiallinen induktio tehosti hermosoluerilaistusta johtaen korkeaan solupuhtauteen ja saantoon. Erilaistusajan pidennys lisäsi endogeenisesti muodostuvien astrosyyttien osuutta viljelmässä ja edisti hermosolujen toiminnallisuudessa havaittua kypsää aktiivisuustyyppiä. Lisäksi valitsemalla viljelypinnoitteeksi tietty laminiini-isoformi saavutettiin vahva, pitkäkestoinen hermosoluaktiivisuus muodostuneissa verkostoissa. Tämän kehitystyön ansiosta kantasoluista johdetut hermoverkot osoittivat samankaltaista ajallista ja vaiheittaista toiminnallisuuden kehitystä, kuin vastaavat jyrsijöistä eristetyt hermosolut. Jyrsijä- ja ihmisverkostojen toiminnallisuuden muodoissa havaittiin kuitenkin myös huomattavia eroavaisuuksia, mikä saattaa liittyä eroihin niiden kypsyysasteissa tai lajien välisiin eroavaisuuksiin. Lopuksi ihmisen monikykyisistä kantasoluista johdetut astrosyytit altistettiin tietyille tulehduksellisille tekijöille. Niiden vaste osoitti keskushermoston sairauksissa tyypillisesti havaitun astroglioosin erityispiirteitä, ja tutkitut hermosoluihin kohdistuvat vaikutukset viittasivat polarisaatioon hermosoluja tukevaksi fenotyyppiksi. Tutkimuksessa luodut kontrolloidut ihmisen hermosolujen ja astrosyyttien yhteisviljelmät tarjoavat vaihtoehtoisen kantasolupohjaisen alustan solujen vuorovaikutusten mallintamiseksi sekä terveessä että sairauskonteksteissa.

Yhteenvetona voidaan todeta, että tämän väitöskirjan tulokset edistävät toiminnallisten ihmisen monikykyisistä kantasoluista johdettujen hermosoluverkkojen kehittämistä, ne vahvistavat astrosyyttien roolia merkittävinä kumppaneina näissä verkostoissa sekä rohkaisevat kantasolujen soveltamiseen ihmisspesifisinä malleina neurotieteen tutkimuksissa.

Our understanding of human brain development and function is still incomplete. Unfortunately, the field of neuroscience lacks representative human-specific models to accompany the animal studies. Access to human brain tissue for research purposes is limited, encouraging the utilization of novel approaches such as human pluripotent stem cell (hPSC)-derived neurons. Within the last few decades, research on hPSCs has undergone enormous expansion. Growing expectations are aimed at the application of stem cells and their derivatives in regenerative medicine, drug screening and disease modeling.

The main focus of this thesis was to evaluate the potential of hPSC-derived neural cultures in mimicking certain characteristics of central nervous system (CNS) development and functionality. The results were intended to help validate the utility of stem cell models for translational neuroscience applications. For this purpose, the differentiation capacities of hPSC-derived neuronal cells generated with two generally used differentiation methodologies were compared. The functional maturation of neurons following a prolonged differentiation time and optimization of culture conditions was assessed in network-level analyses. The results were complemented with a functional comparison to the widely used rodent in vitro model. Since astrocytes are the cells surrounding neurons and supporting neuronal functionality in the CNS, special focus was also placed on their role in both normal and neuroinflammatory conditions, the latter of which is typical of CNS insults.

The results of this thesis suggest that hPSC-derived neuronal cultures recapitulate many of the characteristics of CNS development in vivo. Specific chemical induction accelerated neural differentiation, leading to high cell purity and yield. Prolongation of the differentiation time increased the proportion of endogenously formed astrocytes and promoted the functionally mature activity type of neurons. Furthermore, the emergence of robust neuronal activity and the long-term maintenance of functional networks were achieved with the selection of defined laminin isoform as a culture substrate. With this improvement, the hPSC-derived networks exhibited time frames and stages of activity development similar to those of their rodent counterparts. However, marked variability was detected in the activity patterns between the rodent and human networks, which could relate to differences in their maturation stage or interspecies dissimilarities. Finally, hPSC-derived astrocytes were exposed to specific inflammatory stimuli. Their response showed distinct characteristics of astrogliosis observed in CNS diseases, and the studied neuronal effects suggested polarization into a neurosupportive phenotype. Established controlled co-cultures with human neurons and astrocytes provide an alternative hPSC-based platform for modeling cell interactions in the context of health and disease.

In conclusion, the work presented in this thesis advances the development of functional hPSC-derived neuronal networks, confirms the role of astrocytes as significant partners in these networks, and encourages their translation into human- specific models for neuroscience research.