TRPA1 as a Novel Factor and Drug Target in Osteoarthritis

Abstract

Nivelrikko on merkittävä kipua aiheuttava ja toimintakykyä heikentävä sairaus. Nivelrikko on koko nivelen sairaus, jossa rusto vaurioituu ja häviää lopulta kokonaan erityisesti kantavilta nivelpinnoilta. Tämä johtuu anabolisten, katabolisten ja tulehduksellisten tekijöiden epätasapainosta nivelrikkorustossa. Rustosolut ovat nivelrikossa merkittävässä osassa tuottaen tulehduksellisia ja katabolisia tekijöitä, kuten rustomatriksia hajottavia entsyymejä, reaktiivisia happiyhdisteitä, sytokiineja sekä kasvutekijöitä. Nivelrikon etiologia tunnetaan huonosti, eikä aktiivisesta tutkimustyöstä huolimatta ole onnistuttu kehittämään taudin etenemistä estävää tai hidastavaa lääkehoitoa. Nivelrikon kulkua hidastavien lääkeaineiden kehityksen kannalta on tärkeää saada uutta tietoa nivelrikkoon johtavista molekyylitason mekanismeista, sekä tunnistaa uusia lääkevaikutuskohteita.

TRPA1 (engl. transient receptor potential ankyrin 1) on solukalvolla ilmentyvä ionikanava. TRPA1:tä on pääasiassa tutkittu sensorisissa neuroneissa, joissa se välittää kipua ja neurogeenista tulehdusta. TRPA1:n fysiologisena tehtävänä on toimia aistinreseptorina useille elimistölle haitallisille kemiallisille ärsykkeille. Tämän lisäksi TRPA1:n on hiljattain havaittu aktivoituvan myös joidenkin tulehdusreaktioissa ja hypoksiassa syntyvien molekyylien vaikutuksesta. Nämä olosuhteet ovat nivelrikkorustolle ominaisia, eikä rustossa ole hermosoluja, joten syntyi uusi näkökulma TRPA1 tutkimukseen: voisiko TRPA1 ilmentyä hermosolujen lisäksi myös rustosoluissa.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia TRPA1-ionikanavan ilmentymistä ja vaikutuksia rustosoluissa sekä rustokudoksessa. Tavoitteena oli tuottaa uutta tietoa nivelrikon tautimekanismeihin liittyvistä tekijöistä, sekä selvittää TRPA1:n mahdollista roolia lääkevaikutuskohteena nivelrikossa. Lisäksi tutkittiin farmakologisten inhibiittorien sekä tulehdusta estävien lääkeaineiden vaikutuksia TRPA1:n ilmentymiseen. Tutkimuksessa hyödynnettiin nivelrikkopotilailta tekonivelleikkauksen yhteydessä poistettavaa rustokudosta ja siitä eristettyjä rustosoluja, ihmisen rustosolulinjasoluja sekä TRPA1 poistogeenisiltä hiiriltä ja vastaavilta villityypin hiiriltä eristettyä rustokudosta ja rustosoluja.

Tutkimuksen tulokset osoittivat funktionaalisen TRPA1-ionikanavan ilmentyvän ihmisen nivelrikkorustosoluissa sekä rustosolulinjan soluissa. TRPA1:n ilmentyminen lisääntyi, kun soluja stimuloitiin nivelrikon patogeneesin kannalta keskeisillä tulehdustekijöillä, kuten interleukiini (IL)-1:llä. TRPA1:n havaittiin välittävän usean tulehduksellisen ja kataboliaan liittyvän tekijän tuottoa rustosoluissa/rustokudoksessa. TRPA1:n estäminen vähensi sytokiinien IL-6, IL-11 ja LIF (engl. leukemia inhibitory factor), fibroblastikasvutekijä-2:n (FGF-2:n), prostaglandiini E₂:n (PGE₂:n), sekä rustokudosta hajottavien matriksimetalloproteinaasi (MMP)-1, MMP-3 sekä MMP-13 entsyymien tuottoa. Tutkittaessa tarkemmin FGF-2:n vaikutuksia rustossa ja rustosoluissa, havaittiin sillä olevan rustokudokselle haitallisia katabolisia ja anti-anabolisia vaikutuksia. Lisäksi tulehdusta vaimentavat lääkkeet deksametasoni ja aurotiomalaatti estivät TRPA1-kanavan ilmentymistä ihmisen rustosoluissa.

Tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa on osoitettu funktionaalisen TRPA1-ionikanavan ilmentyvän rustosoluissa. Tutkimuksen tulokset osoittivat TRPA1:n ilmentymisen lisääntyvän nivelrikkonivelelle tyypillisten tulehdustekijöiden vaikutuksesta, sekä TRPA1:n välittävän useiden tulehduksellisten ja katabolisten tekijöiden tuottoa rustosoluissa/rustossa. Tulokset viittaavat siihen, että TRPA1 voi välittää nivelrustovaurioita edistäviä vaikutuksia nivelrikkonivelessä. Tämä tutkimus on tuottanut uutta tietoa nivelrikon tautimekanismeista sekä uudesta mahdollisesta lääkevaikutuskohteesta. Lisäksi tämän väitöskirjan tutkimustulokset tuovat uutta arvokasta tietoa TRPA1:n ilmentymisestä hermoston ulkopuolella.

Osteoarthritis (OA) is the most common joint disease and one of the leading causes of disability worldwide. The hallmark of the pathogenesis of OA is cartilage degradation, which is driven by an imbalance between the production of catabolic, anabolic and inflammatory factors within the joint. Chondrocytes are considered to be essential in this reaction, and during OA they produce increased amounts of inflammatory and catabolic agents, such as matrix degrading enzymes, reactive oxygen species, cytokines and growth factors. There is currently no disease-modifying drug treatment available to prevent or retard the progression of OA. In order to develop improved treatment modalities, identification of novel drug targets, and a better understanding of the molecular pathways involved in the pathogenesis of OA are imperative.

Transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) is a membrane bound ligand- gated cation channel, which has primarily been studied in sensory neurons for its roles in pain and neurogenic inflammation. TRPA1 was initially found to function as a chemosensor for potentially harmful exogenous compounds. However, more recent studies indicate that it can possibly also be expressed in tissue cells and be activated by endogenous factors formed during inflammation and hypoxia. Due to these new findings, we hypothesized that TRPA1 may also be expressed and functional in nonneuronal cells, particularly in chondrocytes, within the OA joint.

The aim of the present study was to examine the expression and effects of TRPA1 in chondrocytes and cartilage, in order to produce novel data on the factors involved in the pathogenesis of OA, and ultimately to assess the potential of TRPA1 as a novel drug target in OA. In addition, the effects of anti- inflammatory drugs on TRPA1 expression were investigated. We utilized cartilage and chondrocytes from OA patients undergoing knee replacement surgery, immortalized human T/C28a2 chondrocytes, as well as cartilage and chondrocytes from TRPA1 knock-out and corresponding wild-type mice.

TRPA1 was discovered to be functionally expressed in human OA chondrocytes and an immortalized chondrocyte cell line. The expression of TRPA1 was increased following stimulation with OA-related inflammatory factors, most notably the cytokine interleukin (IL)-1β, which is traditionally considered one of the significant inflammatory mediators driving the pathogenesis of OA. TRPA1 was shown to be involved in the upregulation of inflammatory and catabolic factors IL-6, IL-11, leukemia inhibitory factor (LIF), fibroblast growth factor (FGF)-2, matrix metalloproteinase (MMP)-1, MMP-3, MMP-13, and prostaglandin E2 in chondrocytes/cartilage. The effects of FGF-2 in cartilage and chondrocytes were also examined further, and FGF-2 was shown to exert catabolic and anti-anabolic effects, which were reversed by specific FGF receptor antagonists. Additionally, the clinically used anti-inflammatory drugs dexamethasone and aurothiomalate, as well as inhibition of the transcription factor NF-κB, downregulated the expression of TRPA1 in chondrocytes. This is the first study to show the expression of a functional TRPA1 channel in chondrocytes. The enhanced expression of TRPA1 by OA-related inflammatory mediators, and the TRPA1-mediated increase in the production of pro-inflammatory and catabolic factors in chondrocytes and cartilage, point to a detrimental role for TRPA1 in the pathogenesis of OA. Further, the clinically used anti-inflammatory drugs dexamethasone and aurothiomalate decreased the expression of TRPA1 in chondrocytes, suggesting that TRPA1 may already be a previously unidentified target of anti-inflammatory drug treatment. Taken together, this study has produced novel data on the inflammatory factors involved in the pathogenesis of OA and presents TRPA1 as a potential novel target for future drug development. Additionally, this thesis has produced valuable information on the nonneuronal expression of TRPA1, expanding our knowledge of this multifunctional ion channel.