In Vitro and in Vivo Osteogenesis and Vasculogenesis in Synthetic Bone Grafts

Abstract

Luukudos on heti veren jälkeen maailman käytetyin kudossiirre ja väestön ikääntyessä luusiirteiden tarpeen odotetaan nousevan nykyisestä. Mittavista panostuksista huolimatta biomateriaalikehityksessä ja -tutkimuksessa, potilaiden hoidossa synteettisiä luusiirteitä käytetään huomattavasti vähemmän kuin autologisia luusiirteitä. Uusien synteettisten luusiirteiden kehityksessä tarvitaan tehokkaita ja luotettavia soluviljelymenetelmiä arvioimaan materiaalien kykyä tukea luun ja verisuonien muodostumista. Aikuisen kantasolut, kuten rasvakudoksen ja luuytimen kantasolut, jotka pystyvät erilaistumaan sekä luusoluiksi, että verisuonten endoteelisoluiksi, ovat erinomainen työkalu tähän tarkoitukseen. Toimivia ja kustannustehokkaita menetelmiä luu- ja endoteelierilaistukseen täytyy kuitenkin vielä kehittää. Tämä väitöskirjassa tutkitaan strategioita aikuisen kantasolujen erilaistukseen 3-ulotteisessa ympäristössä, jotta uusien synteettisten luusiirteiden soveltuvuutta voidaan arvioida luotettavasti.

Kahta kliinisessä käytössä olevaa synteettistä luusiirremateriaalia (BoneCeramic kalsiumfosfaatti ja BioRestore bioaktiivinen lasi) verrattiin rasvakudoksen kantasoluviljelmissä. Samalla tutkittiin yleisesti käytettyjen kasvutekijöiden luun morfogeneettisten proteiinien (BMP)-2, BMP-7 ja verisuonen endoteelin kasvutekijän (VEGF) tehokkuutta rasvakudoksen kantasolujen luuerilaistuksessa. Koska kovien ja hauraiden keraamien istuttaminen siirrekohtaan leikkauksen aikana on vaikeaa ja ne sopivat huonosti kuormaakantaviin kohtiin, tutkimuksessa kehitettiin elastinen β-trikalsiumfosfaatti/poly(L-laktidi-ko-ε-kaprolaktoni) (βTCP/PLCL) komposiitti hyödyntäen ylikriittistä hiilidioksidi prosessointia. Näiden komposiittien kykyä tukea luun ja verisuonten muodostumista tutkittiin sekä rasvakudoksen kantasoluviljelmissä, että kanin reisiluun puutoksessa. Seuraavaksi kehitettiin 3D tulostuksen avulla polykaprolaktoni (PCL)/bioaktiivinen lasi-kupari – komposiitti, jonka soluyhteensopivuutta sekä kykyä tukea luun ja verisuonten muodostumista tutkittiin luuytimen kantasolujen viljelyssä sekä luuytimen kantasolujen ja napanuoran endoteelisolujen yhteisviljelyssä.

BoneCeramic kalsiumfosfaatti ja BioRestore bioaktiivinen lasi vaikuttivat eri tavalla rasvakudoksen kantasoluihin: kalsiumfosfaattirakeet lisäsivät luuerilaistumista, kun taas bioaktiivinen lasi stimuloi solujen jakautumista. Luuerilaistusliuos oli merkittävästi tehokkaampi luuerilaistaja verrattuna kasvutekijöihin rasvakudoksen kantasolujen erilaistuksessa. Rasvakudoksen kantasolut eivät herkistyneet kasvutekijöille myöskään silloin, kun kasvutekijät yhdistettiin luuerilaistuliuokseen.

Kehitetyt β-TCP/PLCL komposiitit tukivat rasvakudoksen kantasolujen elinkykyä, jakautumista ja luuerilaistumista. Rasvakudoksen kantasolut kykenivät erilaistumaan sekä luu- että endoteelisolujen suuntaan komposiiteilla, kun niitä viljeltiin endoteelierilaistusliuoksessa, mutta erilaistuminen jäi vaillinaiseksi. Luu- ja endoteelierilaistusliuosten sekoituksen näytettiin tukevan solujen luu- mutta ei endoteelierilaistumista. Kun komposiitti istutettiin kanin reisiluun puutokseen, luukudoksen todettiin kasvavan komposiitin pinnalla ja sen sisällä jo 4 viikkoa istutuksen jälkeen. Lisäksi se ei aiheuttanut tulehdusta tai saanut aikaan sidekudoksen tai kystien muodostusta.

Kasvavalla kuparipitoisuudella huomattiin olevan sytotoksinen vaikutus luuytimen kantasoluihin, kun soluja viljeltiin PCL/bioaktiivinen lasi-kupari komposiiteilla. PCL/bioaktiivinen lasi komposiitti tuki hyvin luuerilaistumista, kun taas kuparin lisääminen heikensi komposiitin luun muodostuskykyä. Molemmat komposiitit tukivat verisuonirakenteiden muodostumista luuytimen kantasolujen ja napanuoran endoteelisolujen yhteisviljelyssä; kuparilla ei huomattu olevan merkittävää vaikutusta verisuonittumiseen.

Yhteenvetona luuerilaistusliuos on tehokkaampi luuerilaistaja 3-ulotteisessa ympäristössä kuin yleisesti käytetyt kasvutekijät rasvakudoksen kantasoluille. Huokoinen β-TCP/PLCL komposiitti on lupaava synteettinen luusiirre, sillä se on kudosyhteensopiva, luunkasvua johtava ja sitä on helppo käyttää ja muokata leikkauksen aikana. Lisäksi komposiitti tukee rasvakudoksen kantasolujen endoteelierilaistumista, kun niitä viljellään endoteelierilaistusliuoksessa, mutta solujen erilaistus ei kehity kypsien endoteelisolujen tasolle 3 viikon erilaistuksen aikana. Tulostettu PCL/bioaktiivinen lasi komposiitti tukee luuerilaistumista sekä verisuonittumista, mutta kuparin lisääminen komposiittiin heikentää luuerilaistumista eikä paranna verisuonittumista. Tämä tutkimus osoittaa, että yhdistämällä luunkasvua johtavia keraameja synteettisiin polymeereihin voidaan luoda hyvin lupaavia, elastisia synteettisiä luusiirremateriaaleja verrattuna koviin keraameihin.

Bone tissue is the second most common tissue transplant after blood transfusion and as people age, the need for bone transplants is expected to rise even more. Despite the great efforts in biomaterial research and development, autologous bone remains the benchmark among bone grafts whereas synthetic bone grafts are still less-used. Effective and reliable development of synthetic bone grafts require efficient cellular assessments in vitro including the evaluation of osteogenic as well as vasculogenic potential of the scaffolds. Adult stem cells, including human adipose stem cells (hASCs) and human bone marrow stem cells (hBMSCs), provide an excellent tool for this as they have been shown to differentiate to bone-forming cells and endothelial cells. However, efficient and cost-effective approaches to induce osteogenic and endothelial differentiation are still needed. This thesis focuses on the study and development of in vitro differentiation strategies for hASCs and hBMSCs in 3-dimensional (3D) culture in order to study and verify the feasibility of novel bone substitute materials.

Firstly, two clinically used synthetic bone graft scaffolds, BoneCeramic composed of biphasic calcium phosphate and BioRestore composed of bioactive glass (BaG), were compared in hASC culture and, the effectiveness of commonly used growth factors bone morphogenetic protein (BMP)-2, BMP-7 and vascular endothelial growth factor (VEGF) on hASC osteogenesis were compared to OM. As ceramics are hard and brittle making them difficult to implant and undesirable to load-bearing sites, an elastic β-tricalciumphosphate/poly(L-lactide-co-ε-caprolactone) (βTCP/PLCL) composite was developed using supercritical CO2 (scCO2) foaming. The capacity of the composites to support hASC osteogenesis and vasculogenesis were studied in vitro in hASC culture and in vivo in rabbit femur defect. Finally, 3D printed polycaprolactone (PCL)/copper-doped BaG composites were developed and their osteogenic and vasculogenic potential was studied in vitro in hBMSC culture and in a co-culture of hBMSCs and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).

The two biomaterial scaffolds BoneCeramic and BioRestore demonstrated differential effects on hASCs: BoneCeramic induced ALP activity and collagen production of hASCs, while BioRestore stimulated hASC proliferation. In comparison to the growth factors, OM was more effective in the osteogenic differentiation of hASCs in vitro in BoneCeramic and BioRestore. On the other hand, combining the growth factors with OM did not sensitize hASCs to the growth factors.

The β-TCP/PLCL composites supported the viability, proliferation and osteogenic differentiation of hASCs reliably in vitro. When studying the osteogenic and endothelial differentiation of hASCs in β-TCP/PLCL composites, hASCs differentiated towards both lineages when cultured in endothelial medium (EM) although the differentiation was left in a premature state. Culture in a cocktail medium of OM and EM supported osteogenic but not endothelial differentiation of hASCs. The in vivo study confirmed biocompatibility as well as osteoconductivity of the composite as no inflammation, fibrous tissue or cyst formation was detected and, native bone tissue was able to grow on and in the β-TCP/PLCL composite already at 4 weeks.

In the evaluation of 3D printed PCL/BaG-Cu composites, copper was observed to have a dose-dependent cytotoxic effect on hBMSCs in vitro. The PCL/BaG composite induced hBMSC osteogenesis while the addition of copper in BaG had an inhibiting effect on the osteogenic differentiation of hBMSCs. In co-culture of hBMSCs and HUVECs, both PCL/BaG and PCL/BaG-Cu scaffolds supported tubule formation, but the added copper did not boost the vasculogenic effect of the composite.

In conclusion, OM was shown to be a cost-effective osteogenic stimulant in 3D culture as compared to exogenously added growth factors. The feasibility of the scCO2 foamed β-TCP/PLCL composite as potential a bone graft for clinical use was evidenced in vitro and in vivo. The 3D printed PCL/BaG composite showed promise in supporting osteogenesis in vitro whereas the addition of copper hindered the osteogenic effect of the composite. Both PCL/BaG and PCL/BaG-Cu composites supported tubule formation in hBMSC+HUVEC co-culture but the copper did not induce the vasculogenic effect of the composite. To conclude, the elastic and bioactive synthetic polymer -based composites consisting osteoconductive ceramics are highly promising alternatives for synthetic bone grafts when compared to hard ceramics.