Towards Personalized Ocular Surface Diagnosis and Treatment with Tear Fluid Proteomics and Bioinformatics

Abstract

Silmän pinta koostuu sidekalvosta, sarveiskalvosta, kyynelnesteestä ja silmäluomista, jotka yhdessä suojaavat silmää mm. vammoja, ilman epäpuhtauksia, kuivumista, allergeeneja ja taudinaiheuttajia vastaan. Yhdessä silmän pinnan osat muodostavat toiminnallisen kokonaisuuden, jonka häiriöt voivat johtaa silmän pintasairauksien syntymiseen. Samankaltaisiin silmän pinnan kliinisiin löydöksiin ja koettuihin oireisiin on useita mahdollisia syitä, mikä osaltaan vaikeuttaa näiden sairauksien tarkkaa diagnosointia sekä hoidon suunnittelua. Proteomiikan alalla viime vuosina saavutetut edistysaskeleet ovat kuitenkin mahdollistaneet pienen kyynelnestenäytteen proteiinien ilmenemistasojen analysoinnin ja siten myös silmän pinnan sairauksien taustalla olevien toimintojen tutkimisen. Nykyteknologian avulla proteomiikka-analyysit voidaan suorittaa yksittäisille potilasnäytteille, jolloin vältytään näytteiden yhdistämiseltä ja mahdollistetaan potilaiden yksilöllisempi tutkimus. Tällainen lähestymistapa tarjoaakin uusia keinoja silmän pinnan sairauksien tarkkaan diagnosointiin sekä yksilöllisten hoitojen valintaan.

Väitöskirjatyössä oli kaksi päätavoitetta. Ensimmäisenä tavoitteena oli tutkia yleisiä silmän pinnan sairauksia ja sitä, miten mahdolliset hoidot ja ympäristö vaikuttavat yksittäisten potilaiden kyynelnesteproteiinien ilmenemistasoihin. Näillä tutkimuksilla pyrittiin löytämään uusia hyödynnettäviä merkkiaineita eli biomarkkereita, joiden avulla voidaan parantaa silmän pinnan sairauksista kärsivien potilaiden hoitoa ja elämänlaatua. Väitöskirjan toisena tavoitteena oli tutkia tarkemmin sitä, mitkä tekijät vaikuttavat kyynelnesteproteomiikalla tuotettuun aineistoon ja tulisi siten ottaa bioinformatiikan analyyseissa huomioon. Moderni kyynelnesteproteomiikka ja tulosten bioinformatiikka-analyysit ovat suhteellisen nuoria tutkimusaloja. Tietoa uusista tutkimuskäytännöistä tarvitaan, jotta tutkimukset voidaan tehdä mahdollisimman tehokkaasti ja toistettavasti.

Tämä väitöskirja koostuu neljästä osajulkaisusta, joissa arvioidaan sekä silmän pinnan normaalitilaa että sairauden aiheuttamia muutoksia. Koska potilaiden silmän pinnan tilaan voi sairauksien lisäksi vaikuttaa myös normaalit ominaisuudet, kuten korkea ikä ja sukupuoli, molempia on tässä työssä tutkittu kyynelnesteen proteomiikan avulla. Kaksi ensimmäistä osatyötä keskittyvät kahteen yleiseen silmän pintasairauteen, kuivasilmäisyyteen ja glaukooman hoidosta johtuvaan silmän pinnan sairauteen, joita molempia tutkittiin hoitovasteen kautta. Molemmissa tutkimuksissa potilaiden kyynelnestettä kerättiin useiden käyntien yhteydessä ja näytteet analysoitiin käyttäen massaspektrometriä ja SWATH-MS-menetelmää. Tarkoituksena oli selvittää, miten kyseisten sairauksien hoito ja/tai ympäristön muutokset vaikuttavat potilaiden kyynelnesteen proteiineihin ja biologiseen toimintaan. Jälkimmäiset kaksi tutkimusta tarkastelivat normaalin ikääntymisen ja näytteenottomenetelmien tuomia eroja. Molemmat tutkimukset koostuivat ns. normaaleista verrokeista/tutkimushenkilöistä, joilla ei ollut aiemmin todettuja silmän pintasairauksia. Massaspektrometrian ja bioinformatiikan avulla näissä tutkimuksissa analysoitiin sitä, mitkä kyynelnesteproteiinit muuttuivat normaalin ikääntymisen ja näytteenottomenetelmän vaihtumisen myötä.

Kuivasilmäisyys- ja glaukoomalääkevaihtotutkimukset paljastivat, että vaikka potilaat muodostaisivatkin alustavasti kliinisten oireidensa ja taustojensa perusteella suhteellisen homogeenisen ryhmän, potilaiden proteiiniprofiilit voivat vaihdella, mahdollistaen potilaiden jaottelun erilaisiin vasteryhmiin. Proteomiikka-aineistoa voi siis käyttää potilaiden silmän pinnan tilan yksilölliseen arviointiin, hoitovaihtoehdon valintaan sekä hoitovasteen ennustamiseen, mikä ei välttämättä olisi mahdollista pelkkien kliinisten tietojen perusteella. Tutkimukset, joissa tutkittiin normaalin ikääntymisen ja kyynelnesteen näytteenottomenetelmien eroja osoittivat molempien muuttujien olevan hyvin tärkeitä kyynelnesteproteomiikassa. Useat tulehdusta edistävät proteiinit nousevat iän myötä ja tästä syystä kyynelproteomiikkatutkimuksissa olisi tärkeää muodostaa potilasryhmät saman ikäisistä potilaista tai huomioida potilaiden iät data-analyyseissä. Lisäksi, eri tavoilla otetut kyynelnestenäytteet (Schirmer liuska ja kapillaari) eroavat merkittävästi sekä proteiinien tunnistuksen että ilmenemistasojen osalta. Tästä syystä tutkijoiden olisi hyvä harkita jo tutkimusta suunnitellessaan, millaisesta tiedosta ja proteiineista he ovat kiinnostuneita ja valita tämän perusteella tutkimukseen sopivin näytteenottomenetelmä.

Kokonaisuudessaan väitöskirjan tutkimukset antavat tietoa kyynelnesteproteomiikan avulla tehtävien tutkimusten mahdollisuuksista ja rajoituksista sekä luovat pohjaa parhaiten sopivien data-analyysimenetelmien valinnalle. Väitöskirjassa esitetyt tulokset osoittavat, että kyynelnesteproteomiikan analysointi on tehokas ja kajoamaton tapa arvioida silmän pinnan tilaa, ja sitä on mahdollista käyttää myös lisäkeinona yksittäisten potilaiden diagnostiikassa, hoitomenetelmien kehittämisessä ja valinnassa sekä hoitotulosten seurannassa. Proteomiikka tulee todennäköisesti olemaan tulevaisuudessa tärkeä osa henkilökohtaisen lääketieteen tutkimusta ja kohdennettujen hoitomenetelmien kehitystä.

Ocular surface, consisting of conjunctiva, cornea, tear fluid and eyelids, is the first line of defence in the eye, protecting it from environmental threats such as pollution, desiccation, injuries, allergens and pathogens. These parts of the ocular surface form a functional unit and any dysfunction in it can easily throw the system off balance, causing an ocular surface disease. Hence, there are several potential causes for ocular surface disease signs and symptoms experienced by patients, which makes diagnosis and treatment of these conditions challenging. However, recent advances in the field of proteomics have made it possible to study the underlying biological functions of ocular surface diseases by evaluating the protein expression levels in tear fluid. With current technology, the data analysis can be performed on individual samples, this way avoiding pooling and enabling more personalized research approach. This type of approach can provide new tools for accurate diagnosis and personalized therapy selection for ocular surface diseases.

This dissertation had two main aims. The first aim was to examine common ocular surface diseases and how individual patients’ protein expression levels are affected by treatment and/or environment. This type of bioinformatics research focuses on the discovery of new biomarkers, which could improve the treatment and quality of life of patients suffering from ocular surface diseases. The second main aim of this dissertation was to advance the understanding of the factors affecting tear fluid proteomics data and the associated bioinformatics analyses. Since the field of proteomics, and tear fluid proteomics in particular, is still relatively new, there is a lot to be learned about the underlying factors affecting tear fluid proteomics and how studies should be conducted most efficiently.

This dissertation consists of four separate studies, which evaluate both the normal and diseased states of the ocular surface. More specifically, as both specific diseases as well as non-pathophysiological patient characteristics, such as age and sex, can affect the condition of ocular surface, both have been examined with tear fluid proteomics. The first two studies are focused on common eye diseases, in this case dry eye disease and glaucoma therapy-induced ocular surface disease, which were studied in relation to their treatment effects. In both studies, patients’ tear fluids were sampled in multiple visits and the samples were analysed with a mass spectrometer implementing sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ion (SWATH-MS) method, in order to discover what proteins and thus biological functions are affected by treatment and/or environmental changes in individual patients. The latter two studies of this dissertation examined the effects of normal aging and differences between common tear fluid sampling methods on the tear fluid proteomics. Both studies consisted of subjects with no previously diagnosed ocular surface diseases, which we considered ‘normal’. Tear fluid sampling, mass spectrometry and bioinformatics analysis were again conducted in order to discover what proteins were changing during normal aging and what proteins were differentially expressed or identified between different sampling methods (Schirmer strip and capillary).

The dry eye disease (DED) and glaucoma medication switch studies revealed that even when the patients would initially form a relatively homogeneous group based on their clinical signs and backgrounds, their proteomic profiles may vary widely and enable further patient stratification. These more detailed analyses of proteomic data can be used to evaluate a patient’s ocular surface condition more accurately and predict the treatment response more reliably than with clinical measures alone. In addition, the studies examining the effects of normal aging and tear fluid sampling methods confirmed that these aspects should not be overlooked prior or during the analysis. Several pro-inflammatory proteins were found to be increased with age and hence, treatment groups in tear proteomics studies should always be age-matched or corrected for age, depending on the availability of data. Capillary and Schirmer strip samples also differed notably in both identification as well as in protein expression levels. Therefore, researchers should carefully consider prior to sampling, the type of information and proteins they are most interested in and what type of sampling would be most suitable for their clinical studies and choose the sampling method based on the answers. Altogether, the studies in this dissertation provide information on what type of bioinformatics analysis could be performed on the available tear fluid proteomics data and more specifically, what type of analysis is most suitable for a given dataset. As a conclusion, this dissertation shows that analysis of tear fluid proteomics data is an efficient and non-invasive way to evaluate the state of the ocular surface and it can be used as an additional tool to determine and develop the most suitable treatments for individual patients. It also points out the importance to know the existing limitations of this technology. Proteomics in general is likely to be an important tool in the precision medicine and in development of personalized treatments in the future.