Carbonic Anhydrase VI : Functional characterization in mouse and zebrafish model organisms

Abstract

Hiilihappoanhydraasit (Carbonic anhydrase, CA) katalysoivat tehokkaasti käänteistä hiilidioksidin ja veden reaktiota bikarbonaatiksi ja protoniksi (CO2 + H2O - HCO3- + H+). Useimmat CA-entsyymit kuuluvat α-, β-, tai γ- luokkaan, jotka eroavat toisistaan sekä aktiivisen keskuksen että ulkoisen rakenteen osalta. CA VI on ainoa rx-luokan erittyvä entsyymi. Se havaittiin ihmisen syljestä ja yhdistettiin makuaistimukseen ensimmäistä kertaa 1970-luvulla ja nimettiin ’gustiini’ - entsyymiksi. Vuonna 1979 CA-entsyymi löydettiin lampaan sylkirauhasesta ja syljestä. Ihmisen syljestä eristetty entsyymi nimettiin CA VI:ksi vuonna 1987. Vuonna 1998 osoitettiin, että ’gustiini’ ja CA VI ovat keskenään identtisiä. Ihmisellä CA VI-entsyymiä erittyy syljen lisäksi myös maitoon. Oman tutkimukseni tarkoituksena on ollut hankkia uutta tietoa erittyvän CA-entsyymin ilmentymisestä ja toiminnasta.

Tutkimuksessa käytettiin kahta koe-eläinmallia: Car6 poistogeenisiä hiiriä sekä seeprakaloja, joiden vastaava geeni oli hiljennetty morfoliinotekniikalla.

Car6 poistogeenistä hiirimallia käytettiin sekä makuaistimuksen että geenien ilmentymisen tutkimiseen. Tuloksia verrattiin normaalien villin tyypin (WT) hiirten tuloksiin. Tutkimuksessa tarkasteltiin cDNA-mikrosirutekniikan avulla, miten CA VI-entsyymin poisto vaikuttaa geenien ilmentymiseen henkitorvessa ja keuhkoissa. Kahden hiiriryhmän välisiä eroja selvitettiin tilastotieteellisillä menetelmillä.

Hyönteissoluissa geenitekniikan avulla tuotetun seeprakalan CA VI-proteiinin rakenteen kartoitukseen käytettiin staattista (SLS) ja dynaamista (DLS) valonsirontamenetelmää, joita ennen proteiini puhdistettiin kromatografiamenetelmillä. Massaspektrometriaa varten proteiinirakenne pilkottiin trypsiinin avulla. Proteiinirakenne, siinä esiintyvät sokerointikohdat ja sokeriosien rakenteet analysoitiin CID-MS/MS-massaspektrometrialla.

Tutkimuksen eri vaiheissa tuloksina saadut nukleotidi- ja aminohapposekvenssit analysoitiin käyttämällä lukuisia bioinformatiikan työkaluja. CA VI- entsyymin merkitystä seeprakalan kehityksessä tutkittiin hiljentämällä ca6-geeni alkioista, minkä jälkeen tarkasteltiin kalojen kehitystä ja uintikäyttäytymistä.

Makuaistimuskokeen tulokset osoittivat Car6-/- -hiirten suosivan veden juomisen n 0.003 mM kiniiniliuosta, kun taas WT hiiret suosivat vettä.

Mikrosirumenetelmällä saadun datan analyysi osoitti geenien ilmentymiseroja sekä henkitorvessa että keuhkoissa Car6-/- poistogeenisten ja WT hiirten välillä. VLAD- analyysi osoitti muutoksia aineenvaihdunnan prosesseissa, biologisessa säätelyssä, yhden organismin prosesseissa sekä limakalvoon liittyvän kudoksen immuunivasteessa. Sekvenssianalyysi osoitti, että seeprakalan CA VI:n C-terminaalipäähän on liittynyt pentraksiiniproteiini. Valonsironta- ja geelisuodatusanalyysien tuloksena proteiini ilmenee oligomeerina, ja molekyylin koon perusteella sen voidaan arvioida esiintyvän pentameerina. Sekä CA VI- että PTX-domeeneissa on rikkisiltoja. Seeprakalan CA VI-PTX -kudosvärjäys osoitti positiivista signaalia solun pinnalta ihossa, sydämessä, kiduksissa sekä uimarakossa. ca6 geenin hiljentämisen jälkeen neljän päivän ikäiset poikaset eivät pystyneet uimaan normaalisti lähellä veden pintaa joko uimarakon hidastuneen kehittymisen tai sen täyttymiseen liittyvien ongelmien vuoksi, kun taas WT poikaset uivat normaalisti. Viiden päivän iässä ca6-hiljennettyjen poikasten uimarakko täyttyi ja uintikyky tuli normaaliksi.

Poistogeenisen hiirimallin avulla osoitimme, että CA VI osallistuu karvaan maun aistimukseen. CA VI, jota erittyy runsaasti sylkeen ja maitoon voi olla yksi tekijä, joka auttaa välttämään karvaan makuisia ja mahdollisesti myrkyllisiä aineita. Seeprakalan CA VI-entsyymiin liittyvien tutkimusten avulla saatiin runsaasti uutta tietoa CA- entsyymien evoluutiosta sekä CA VI-PTX-proteiinin ilmentymisestä, rakenteesta ja toiminnasta.

Carbonic anhydrases (CAs) efficiently catalyze the reversible hydration reaction of carbon dioxide (CO2 + H2O - HCO3- + H+). Major CA families belong to the α-, β-, or γ-classes and have different features in terms of both their overall structure and active site. Carbonic anhydrase VI (CA VI) is the only secreted isozyme in the rx-CA enzyme family. In the 1970s, a novel taste-associated secreted protein was identified in human saliva and named Gustin. The same protein was observed in a sheep parotid gland and saliva in 1979 and was classified as a CA based on its protein sequence. Two decades later, in 1998, Gustin was proven to be identical to the CA VI enzyme. CA VI is one of the major protein constituents of human saliva and milk. The general aim of this study was to reveal new information about the expression and function of secretory CA VI.

We used two independent animal models in our studies focused on CA VI. First, a Car6 knockout mouse (KO) model was utilized to evaluate the differences in taste modalities between CA VI-deficient and wild-type (WT) mice. Then, we further investigated by cDNA microarray whether the gene expression profiles differed between KO and WT mice with a focus on the trachea and lung. Second, we used zebrafish to investigate the role and distribution of CA VI in another vertebrate animal model. The recombinant zebrafish CA VI protein was produced in insect cells. The protein was purified using chromatography methods and characterized by static and dynamic light scattering (SLS and DLS) analyses and by mass spectrometry (MS). Verification of glycosylation sites and glycan structures was carried out using Collision Induced Dissociation with Tandem Mass Spectrometry (CID-MS/MS). Sequence analysis was performed by various bioinformatics tools. The functional significance of the CA VI enzyme to zebrafish was studied by silencing the gene encoding the enzyme, and its effect on the phenotype was examined.

The comparison of taste modalities showed that Car6-/- mice significantly preferred a0.003 mM quinine solution to water, whereas WT mice preferred water. The microarray data analysis results showed a number of differentially expressed genes in the trachea and lung when comparing the WT and Car6 -/- mice groups. A Gene List Analysis and Visualization tool (VLAD) analysis resulted in changes in a metabolic process, biological regulation, single-organism process, and an immune response in mucosal-associated lymphoid tissue.

Sequence analysis of zebrafish CA VI showed that there was an additional pentraxin (PTX) protein attached to the C-terminus of CA VI. Light scattering combined with gel filtration analysis indicated oligomeric assembly for the protein, with a pentameric configuration being the most plausible form. Both the CA VI and PTX domains contained either intra- or interpeptide disulfide bonds. Localization analysis of CA VI-PTX in various zebrafish tissues showed the strongest positive staining signal on cell surfaces in the skin, heart, gills, and swim bladder. Underdeveloped or deflated swim bladders of CA VI-PTX knockdown (KD) larvae were observed at 4 days post fertilization (dpf), whereas fish gained the ability to inflate their swim bladder and started to swim normally at 5 dpf.

Our KO mouse model confirms that CA VI is involved in bitter taste perception. As one of the major protein constituents of saliva and milk, CA VI may be one of the factors that contributes to the avoidance of bitter, potentially harmful, substances. Several findings on zebrafish CA VI give novel insights into the evolution, structure, and function of this unique CA form.