Microsomal Prostaglandin E Synthase-1 in Osteoarthritis

Abstract

Prostanoidit (prostaglandiinit, prostasykliini ja tromboksaani) ovat säätely- ja viestimolekyyleinä toimivia rasvahappojohdannaisia. Ne syntetisoidaan arakidonihaposta, jota vapauttavat solukalvoista fosfolipaasi A2- entsyymit. Syklo- oksigenaasi (COX) –entsyymien katalysoimissa hapetus- ja pelkistysreaktioissa arakidonihaposta muodostuvat välituotteet PGG2 ja PGH2, joiden isomerisaatio prostaglandiineiksi, prostasykliiniksi ja tromboksaaniksi tapahtuu edelleen kullekin lopputuotteelle spesifisen syntaasin katalysoimassa reaktiossa. Prostaglandiini E2 (PGE2) on keskeinen PG ja sitä tuottavat lähes kaikki elimistön solut. Sen tuotto on lisääntynyt tulehdustaudeissa, ja se välittää monia tulehdukseen liittyviä kliinisiä vaikutuksia, kuten kudosturvotusta, punoitusta, kipua ja kuumetta. PGE2:ta tuottaa kolme terminaalista syntaasia: sytosolinen PGE syntaasi (cPGES), sekä mikrosomaaliset PGE syntaasit 1 ja 2 (mPGES-1, mPGES-2). cPGES:n ja mPGES-2:n ilmentyminen on jatkuvaa, kun taas mPGES-1:n ilmentyminen lisääntyy tulehduksen yhteydessä esim. bakteeriperäisten tuotteiden ja tulehdusta voimistavien sytokiinien vaikutuksesta. mPGES-1:n ilmentymisen on havaittu lisääntyneen monissa tulehduksellisissa sairauksissa kuten nivelrikossa ja reumassa. Kokeellisessa niveltulehdusmallissa tulehdusvasteet, radiologiset muutokset ja kipu olivat lievemmät mPGES-1 poistogeenisillä hiirillä kuin tavallisilla (villityypin) hiirillä.

Nykyään käytössä olevien tulehduskipulääkkeiden pääasiallinen vaikutusmekanismi on COX-entsyymien toiminnan esto. Tällöin PGE2:n lisäksi myös muiden prostaglandiinien tuotanto vähenee, minkä katsotaan johtavan tulehduskipulääkkeille ominaisiin haittavaikutuksiin. On esitetty, että spesifisesti mPGES-1:tä estävillä yhdisteillä voitaisiin saavuttaa nykyisin käytössä olevien tulehduskipulääkkeiden terapeuttiset vaikutukset, mutta vähemmän haittavaikutuksia, koska tällöin voitaisiin selektiivisesti vaimentaa PGE2:n tuottoa tulehduksessa vaikuttamatta muihin prostanoideihin tai PGE2:n fysiologiseen tuottoon. Joitakin mPGES-1:n ilmentymiseen vaikuttavia lääkeaineita on löydetty, mutta ilmentymistä säätelevät mekanismit tunnetaan huonosti. mPGES-1:n aktiivisuuteen vaikuttavia lääkeaineita on kehitetty ja myös tutkittu kliinisissä lääketutkimuksissa, mutta yhtään lääkeainetta ei ole vielä kliinisessä käytössä.

Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia mPGES-1:n ilmentymistä niveltulehduksen kannalta tärkeissä kondrosyyteissä ja makrofageissa, sekä selvittää tunnettujen tulehdusta vaimentavien lääkeaineiden vaikutusta siihen. Ensimmäisessä osatyössä todettiin, että nivelreumaan vuosikymmeniä käytetty kultayhdiste, aurotiomalaatti, estää mPGES-1:n ilmentymistä ja PGE2:n tuottoa nivelrikkopotilaiden rustonäytteistä eristetyissä rustosoluviljelmissä ja sen teho oli verrattavissa glukokortikoidiin. Muilla tutkituilla reumalääkkeillä (metotreksaatti, hydroksiklorokiini, sulfsalatsiini) ei havaittu vastaavaa vaikutusta.

Osatöissä II-IV tutkittiin mitogeeniaktivoituvien proteiinikinaasien (MAPK:ien) ja näiden aktiivisuutta estävän endogeenisen fosfataasin, mitogeeniaktivoituvan proteiinikinaasi-1:n (MKP-1:n) roolia mPGES-1:n ilmentymisessä. Glukokortikoideihin kuuluvan deksametasonin ja fosfodiesteraasi 4:n (PDE4:n) estäjä rolipraamin todettiin lisäävän MKP-1:n ilmentymistä, estävän MAPK-reitti JNK:n aktiivisuutta ja tätä kautta vähentävän mPGES-1:n ilmentymistä makrofageissa. Nämä vaikutukset eivät ilmenneet MKP-1 poistogeenisten hiirten soluissa. Neljännessä osatyössä todettiin, että MKP-1 säätelee mPGES-1:n ilmentymistä ja deksametasonin vaikutusta siihen myös rustosoluissa, mutta vaikutus välittyy p38 MAPK-reitin kautta. Tämä todentaa sen, että MAPK-reitit säätelevät mPGES-1:n ilmentymistä solutyypistä riippuvalla tavalla. Viidennessä osatyössä tutkimme selektiivisen mPGES-1:n estäjän vaikutuksia nivelrikkopotilaiden rustosoluissa koko genomin laajuisella ekspressioanalyysillä. Työssä todettiin, että mPGES-1:n estäjä lisäsi endogeenisten sytokiinivastavaikuttajien, interleukiini-1 reseptoriantagonistin (IL-1Ra:n) ja interleukiini-36 reseptoriantagonistin (IL-36Ra:n), tuottoa ja vähensi interleukiini-6 (IL-6)-sytokiinin tuottoa rustosoluissa. Myös metallotioneiini-1:n (MT1:n) alatyyppien tuotanto lisääntyi. MT1:n on todettu toimivan antioksidanttina ja suojaavana tekijänä rustossa. Rustokudokselle selvästi haitallisia vaikutuksia ei todettu.

Tämän väitöstutkimuksen tulokset selventävät mPGES-1:n ilmentymisen säätelyyn vaikuttavia mekanismeja ja tuovat siten uutta tietoa, jota voidaan hyödyntää kehitettäessä mPGES-1:n ilmentymistä vähentäviä uusia lääkeaineita. Tutkimuksessa tunnistettiin myös mPGES-1:n ilmentymisen vaimeneminen uutena mekanismina kahdelle reuman hoidossa käytetylle lääkeaineelle. Lisäksi tulokset tarjoavat uutta tietoa mPGES-1:n estäjien potentiaalisista vaikutuksista nivelrustoon ja nivelrikon tautiprosessiin.

Prostanoids (prostaglandins, prostacyclin and thromboxane) are locally acting lipid mediators. They are synthetized from arachidonic acid, which is released from cellular membrane phospholipids by phospholipase A2. Arachidonic acid is metabolised to prostaglandin G2 (PGG2), and onwards to prostaglandin H2 (PGH2), by cyclo-oxygenase (COX) enzymes. The isomerisation of these intermediate products to prostanoid end products is catalysed by specific terminal enzymes. Prostaglandin E2 (PGE2) is an important prostanoid produced in most cells in the human body. The production of PGE2 is increased in inflammatory conditions, and it is known to mediate the classical signs of inflammation, including swelling, redness, pain and fever. It is produced by three terminal enzymes: cytosolic prostaglandin E synthase (cPGES) and microsomal prostaglandin E synthases-1 and -2 (mPGES-1, mPGES-2). cPGES and mPGES-2 are constitutively expressed, whereas the expression of mPGES-1 is enhanced within inflammation by bacterial products and pro-inflammatory cytokines. The expression of mPGES-1 is increased in many inflammatory diseases, such as osteoarthritis (OA) and rheumatoid arthritis (RA). The inflammatory responses, radiographic progression and pain have been reported to be less severe in mPGES-1 knockout mice as compared to wild type mice in experimental models of arthritis.

The mechanism of action of currently used non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) is based on inhibition of COX enzymes. This leads to a decreased production of PGs other than PGE2, which is assumed to cause the adverse effects typical for NSAIDs. It is believed that by using selective inhibitors of mPGES-1, it is possible to achieve clinical efficacy of NSAIDs with fewer adverse effects, because the production of PGE2 would be selectively decreased without affecting the production of other prostanoids or the physiological production of PGE2. Some inhibitors of mPGES-1 expression have been found, but the regulatory mechanisms behind mPGES-1 expression are not well known. Compounds inhibiting the activity of mPGES-1 have been developed and investigated in clinical trials, but there are none available on the market yet.

The purpose of the present study was to investigate the expression of mPGES-1 in chondrocytes and in macrophages, which are essential cells in the pathogenesis of OA. Moreover, we investigated the effects of some known anti-inflammatory drugs on mPGES-1 expression. In the first study, aurothiomalate, a gold compound used for decades in the treatment of RA, was discovered to inhibit the expression of mPGES-1 and the subsequent production of PGE2 in a manner comparable to glucocorticoids in chondrocytes from OA patients undergoing a joint replacement surgery. The other antirheumatics investigated (methotrexate, sulfasalazine, hydroxychloroquine) did not affect mPGES-1 expression.

In the studies II-IV, we investigated the roles of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and the endogenous mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 (MKP-1), which inhibits their activity, in the expression of mPGES-1. The glucocorticoid dexamethasone, and the phosphodiesterase 4 (PDE4) inhibitor rolipram were found to enhance MKP-1 expression, which subsequently inhibited the activity of c-Jun N-terminal kinase (JNK) pathway and mPGES-1 expression in macrophages. Their effects were attenuated in cells from MKP-1- deficient mice. Dexamethasone enhanced MKP-1 expression also in chondrocytes and subsequently inhibited mPGES-1 expression in an MKP-1-dependent manner. However, in chondrocytes the expression of mPGES-1 seemed to be mediated via p38 pathway, which endorses that the MAPK pathways mediate the expression of mPGES-1 in a cell type-dependent manner. In the study V, we investigated the effects of the mPGES-1 inhibitor MF63 on human OA chondrocytes with a genome-wide expression analysis. The mPGES-1 inhibitor was found to increase the expression of endogenous cytokine antagonists interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) and interleukin-36 receptor antagonist (IL-36Ra), and to decrease the expression of the pro-inflammatory cytokine interleukin-6 (IL-6). Interestingly, MF63 also enhanced the expression of multiple isoforms of metallothionein 1 (MT1), which has an antioxidative and protective role in cartilage. Any obvious signs of changes considered harmful for cartilage were not seen in the analysis.

In the present study we discovered novel mechanisms regulating the expression of mPGES-1, which is essential in terms of development of drugs affecting the adverse expression of mPGES-1. Furthermore, the findings advance the current understanding on the mechanisms of action of aurothiomalate and dexamethasone, two drugs used in the treatment of arthritis. The results also increase our knowledge about the potential effects of mPGES-1 inhibitors on the disease process of osteoarthritis.