Natural and synthetic biomaterials for epithelial repair : Skin and urethral regeneration

Abstract

Ihon ja virtsaputken epiteelivauriot muodostavat merkittävän kliinisen ongelman ja kuorman sekä perusterveydenhuollolle että erikoissairaanhoidolle. Akuuttien ja kroonisten haavojen esiintyvyydeksi on arvioitu 3.7/1000. Virtsaputken epiteelipuutokset muodostavat toisenlaisen epiteeliin liittyvän ongelman. Ongelmat aiheutuvat yleensä synnynnäisten epämuodostumien, vammojen tai tulehdusten seurauksena. Virtsaputken alahalkio (hypospadia) on yleisin peniksen synnynnäinen epämuodostuma, jonka esiintyvyysasteeksi on arvioitu 0.1-0.8%. Näiden ihoon sekä virtsaputkeen liittyvien ongelmien hoito on haastavaa.

Väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli arvioida biomateriaalikalvojen soveltuvuutta ihon ja virtsaputken korjaamisessa. Amnion- ja kitosaanikalvoa tutkittiin ihohaavoilla, kun taas poly(L-laktidi-co-E-kaprolaktoni) (PLCL) ja poly(1,3 trimetyleeni karbonaatti) (PTMC) -kalvoja tutkittiin virtsaputken epiteelivaurioissa. Amnion- ja kitosaanikalvojen soveltuvuuden tutkimiseksi rottien päälaelle tehtiin ihokerrokset läpäisevä haava. Haava mitattiin ja eläimet satunnaistettiin amnion- tai kitosaanikalvoryhmiin sekä vastaaviin kontrolliryhmiin. Haavat peitettiin joko amnion- tai kitosaanikalvoilla ja Aquacelilla tai pelkällä Aquacelilla (kontrolliryhmä). Eläimiä seurattiin 0, 3, 7, 14 tai 21 päivää, jonka jälkeen haavat ja tatuoinnit mitattiin uudelleen, kerättiin verinäytteet interleukiini 4 -määritystä sekä haava-alueet histologista analysointia varten.

Haavakoon mediaanit olivat kolmen päivän kohdalla merkittävästi (p < 0.05) pienemmät sekä amnion- että kitosaanikalvoryhmässä kuin kontrolliryhmässä. Kitosaaniryhmän interleukiini 4 -tasot olivat merkittävästi (p < 0.05) matalammat 7 ja 14 päivän kohdalla kontrolliin nähden. Tulos valkosolumäärien osalta oli samansuuntainen 7 päivän kohdalla. Kitosaanikalvo hävisi haavapinnalta 7 päivän jälkeen.

Virtsaputken epiteelivaurioihin testattiin PLCL- ja PTMC-kalvoja. PLCL ja PTMC -kalvot kuvattiin mikrotietokonetomografialla pintarakenteiden selvittämiseksi. Ihmisen uroteelisoluja viljeltiin PLCL ja PTMC -kalvoilla solujen kiinnittymisen, elinvoimaisuuden sekä uroteelisolujen fenotyypin säilyttämisen osoittamiseksi. Live/dead-värjäyksellä varmistettiin solujen kiinnittyminen sekä elinvoimaisuus. Lisäksi sytokeratiini (CK) 7, 8 ja 19 sekä uroplakiinien (UP) Ia, Ib ja III ilmeneminen määritettiin PLCL ja PTMC -kalvoilla sekä polystyreenillä (kontrolli) tehtyjen soluviljelyiden jälkeen.

PLCL-ryhmässä solujen kiinnittyminen kalvoille oli merkittävästi (p < 0.05) parempaa ensimmäisenä päivänä PTMC-ryhmään nähden. Tosin uroteelisoluja havaittiin viikon kohdalla enemmän PTMC-kalvolla. Live/dead-värjäys vahvisti, että suurin osa kalvoilla viljellyistä soluista oli elinvoimaisia. CK7, 8 ja 19 ilmenivät kaikilla viljelypinnoilla. CK7:n ja CK8:n ekspressio oli merkittävästi (p < 0.05) korkeampi PLCL-kalvolla. CK19 ekspressio oli merkittävästi (p < 0.05) matalampi PLCL- ryhmässä kontrolliin nähden. Kontrolliryhmän ekspressio UPIII:n osalta oli merkittävästi (p < 0.05) korkeampi kuin PLCL-ryhmän. UPIb:n sekä UPIII ekspressio oli merkittävästi (p < 0.05) matalampi PLCL-kalvoilla viljeltyjen solujen osalta PTMC-ryhmään nähden kahden viikon kohdalla. Kalvojen soveltuvuutta virtsaputkessa tutkittiin poistamalla kanin virtsaputkesta soikea alue, joka peitettiin PLCL tai PTMC -kalvolla. Eläimiä seurattiin 2, 4 tai 16 viikkoa, jonka jälkeen eläimet jälleen nukutettiin ja virtsaputket varjoainekuvattiin. Biomateriaalilla peitetty virtsaputken osa kerättiin talteen histologisia sekä immunohistokemiallisia määrityksiä varten.

PLCL-kalvon todettiin olevan kovempaa kuin PTMC-kalvon. Virtsaputken varjoainekuvauksissa merkittäviä kaventumia ei havaittu. Histologisessa analyysissä uroteeli peitti tehdyn epiteelipuutoksen jatkumona 16 viikon kohdalla molemmissa ryhmissä. Uroteelin kehitys kerrostuneeseen suuntaan oli merkittävästi parempaa (p < 0.05) PTMC-ryhmässä 2 ja 16 viikon kohdalla. Molempien kalvojen osalta sytokeratiinivärjäys vahvisti epiteelikerroksen uudelleenmuodostumisen ja kalvojen havaittiin hajoavan 4 viikon seuranta-ajan jälkeen.

Löydösten perusteella kaikki neljä biomateriaalia osoittautuivat kelvollisiksi epiteelivaurioiden korjaamisessa valituissa käyttötarkoituksissa. Amnion- ja kitosaanikalvot edistivät haavan paranemista varhaisvaiheessa. Kitosaanikalvon havaittiin vähentävän tulehdusreaktiota ja vaikuttavan IL-4-välittäjäainereittiin. Virtsaputken korjaamistarkoituksessa PTMC oli PLCL:iin verrattuna helpompi käsitellä, minkä lisäksi epiteelikerros eheytyi sen päällä merkittävästi nopeammin.

Epithelial defects in skin and urethra constitute a major problem, both to society and to individual patients. Acute and chronic wounds comprise a remarkable health issue for basic and special healthcare, with an estimated prevalence of 3.7/1,000. Urethral defects, caused by congenital issues, trauma, or infections, are another kind of clinical epithelial dilemma. Hypospadias is the most common penile congenital malformation, with 0.1–0.8% prevalence rate. Treatment of these epithelial skin and urethral defects is demanding.

In this thesis, the aim was to evaluate the suitability of biomaterial membranes for skin wounds and urethral repair using in vitro and in vivo models. Amniotic (AM) and chitosan (CM) membranes were studied on wound surface, whereas poly(L- lactide-co-s-caprolactone) (PLCL) and poly(1,3 trimethylene carbonate) (PTMC) membranes were studied on urethral defects.

To study the effects of AM and CM, full-thickness wounds were excised and measured on the scalps of rats. The rats were randomized into AM or CM and control groups. The wounds were covered with AM or CM and Aquacel or Aquacel alone (control). The rats were followed up for 0, 3, 7, 14 or 21 days. Wounds and tattooed marks were measured, blood samples withdrawn for an interleukin 4 (IL-4) assay, and wound sites excised for histological analysis after follow-up.

Median wound areas were significantly (p < 0.05) smaller in the AM and CM groups, compared to their controls on day three. IL-4 levels were significantly (p < 0.05) lower in the CM group on days 7 and 14, compared to the control group. In wound histology, the CM group had a significantly (p < 0.05) lower leukocyte count on day 7, compared to the control. Chitosan degraded from the wound surface after day 7.

PLCL and PTMC membranes were studied for urethral defects. PLCL and PTMC membranes were imaged using X-ray microtomography (µCT) to identify their surface structure. Isolated human urothelial cells were cultivated on PLCL and PTMC membranes to verify cell attachment, viability, and maintenance of urothelial phenotype. A live/dead cell assay was performed in order to determine cell attachment and viability by 7 and 14 days of cultivation. In addition, the relative expression of cytokeratins (CK) 7, 8 and 19, and uroplakins (UP) Ia, Ib and III were studied after 2-week human urothelial cell cultivation on PLCL, PTMC or polystyrene (control).

In the PLCL group, cellular attachment was significantly higher on the first day (p < 0.05). In turn, the qualitative analysis showed more urothelial cells on PTMC membrane after the first week. Live/dead staining confirmed that the majority of urothelial cells were viable on both membranes. qRT-PCR revealed the expression of CK7, CK8 and CK19 on PLCL, PTMC and the control, whereas the expression of CK7 and CK8 was significantly (p < 0.05) higher among PLCL-cultivated cells. CK19 expression was significantly (p < 0.05) lower in the PLCL group compared to the control. The expression of UPIII was significantly (p < 0.05) higher in the control than PLCL. The expression of UPIb and also UPIII was significantly (p < 0.05) lower among PLCL-cultivated cells compared to PTMC by two weeks’ cultivation.

An oval urethral defect was excised from rabbits’ penile urethra. PLCL or PTMC membrane was sutured to cover the defect. After 2, 4 or 16 weeks’ follow-up, the rabbits were anesthetized, defect sites were imaged (X-ray), and then excised for histological and immunohistochemistry analyses.

In urethral defects, PLCL membrane was harder than PTMC. Urethrographic examination revealed no signs of urethral strictures at any time points. In the histological analysis, the urothelium was continuous at the 16-week time point in both groups. The progression of urothelium structure towards stratification was significant (p < 0.05) within the PTMC group between 2- and 16-week time points. Cytokeratin staining demonstrated progression of de novo urothelium in both groups. Furthermore, both membranes degraded after the 4-week time point from the defect site.

Based on the findings, all four biomaterials were found to be biocompatible and have potential for full-thickness epithelial repair. AM and CM enhanced early-stage wound healing. CM was found to reduce inflammation and affect the IL-4 pathway, but it degraded from the wound surface after day 7. For urethral regeneration, PTMC was discovered to have better handling properties, and it developed significant epithelial integrity, but PLCL was also found to be suitable.