Expression of Alternative Oxidase Influences Cell Migration

Abstract

Solujen liikkumisella eli migraatiolla on tärkeä rooli yksilönkehityksessä, kudosvaurioiden korjaamisessa, immuunijärjestelmässä sekä yleisesti kudosten toiminnassa. Solumigraation ongelmat liittyvät moninaisiin kehityshäiriöihin ja sairauksiin. Drosophila melanogaster -banaanikärpäsellä puutteellinen solujen migraatio yksilönkehityksen aikana näkyy muun muassa halkiona kärpäsen keskiruumiissa. Solumigraation tutkituimmassa solutason nisäkäsmallissa yksikerroksiseen solupeitteeseen tehdään lineaarinen viilto, joka umpeutuu solumigraation seurauksena. Väitöskirjatyöni tavoitteena oli tutkia, miten mitokondrioiden soluhengitykseen liittyvä signalointi vaikuttaa solumigraatioon erilaisissa tutkimusmalleissa. Tutkimuksessani hyödynsin mallieläintä, joka oli geneettisesti muokattu tuottamaan alkukantaisesta Ciona intestinalis -vaippaeläimestä eristettyä vaihtoehtoista oksidaasia (alternative oxidase, AOX). AOX-entsyymiä ei esiinny selkärankaisilla eikä hyönteisillä, mutta muun muassa mikrobeilla, kasveilla ja joillakin monisoluisilla eläimillä se toimii osana mitokondrion hengitysketjua hapettamalla ubikinolin suoraan käyttäen molekulaarista happea. AOX ohittaa entsyymikompleksit III ja IV ilman protonien kuljetusta. Tutkimuksessani muokkasin mitokondrioiden luontaisen hengitysketjun toimintaa hyödyntäen AOX:ia sekä banaanikärpäs- että nisäkässolumallissa, ja tutkin tämän vaikutuksia yksilönkehityksen aikaiseen signalointiin ja solujen migraatioon. Kokeiden kontrolliksi ja testatakseni johtuuko fenotyypin oireiden lieventyminen AOX:n entsymaattisesta aktiivisuudesta, muokkasin AOX:stä mutaation avulla entsymaattisesti toimimattoman version.

Havaitsin, että Ciona intestinalisista saadun AOX:n lisääminen kärpäsmalliin lievensi aktivoidun GeneSwitch transkriptiofaktorin aiheuttamaa keskiruumishalkiota ja muita kehityshäiriöitä. Hypoteesinani on, että aktiivinen GeneSwitch häiritsee jollakin mekanismilla tumareseptorien viestintää kehityksen aikana. Käyttämällä mutatoitua AOX-kontrollia osoitin, että sytokromioksidaasin vajeesta johtuvia letaaleja kehityshäiriöitä ja liikuntakyvyn ongelmia lieventävä vaikutus perustuu AOX:n entsymaattiseen aktiivisuuteen. Jatkoin käyttämällä mutatoitua AOX:ää osoittaakseni saman pätevän myös GeneSwitchin tuottamiin kehityshäiriöihin. AOX:n ilmentäminen lievensi lisäksi keskiruumishalkiota, joka aiheutui JNK-signalointireitin geneettisestä manipuloinnista. JNK-signalointireitti säätelee keskiruumiin dorsaalisen epiteelin muodostumista ja ohjaa siipiaihioiden solukerrosten migraatiota kärpäsen muodonmuutoksen aikana.

Nisäkkäillä on banaaninkärpäsen keskiruumishalkion kaltaisia keskilinjan kehityshäiriöitä, kuten selkäranka-, huuli-, suulaki- sekä rintalastahalkioita. Monet biologiset toiminnot ja varsinkin JNK-solusignalointireitti ovat säilyneet samankaltaisina ihmisellä ja banaanikärpäsellä, mikä mahdollistaa nisäkässolumallien käytön kärpäsillä saatujen tulosten yleispätevyyden kokeilemiseen sekä AOX:n vaikutusten taustalla olevien molekulaaristen mekanismien tutkimiseen. Näin ollen pystyin hyödyntämään nisäkässoluviljelmään tehtyä lineaarista viiltoa menetelmänä osoittaakseni, että AOX:n ilmentäminen edesauttaa solumigraatiota immortalisoiduissa (mutta ei primaarisissa) hiiren alkion sidekudossoluissa ja korjaa JNK-reitin manipulaation aiheuttamia häiriöitä solujen migraatiossa. Reportterimenetelmät paljastivat, että transkriptiotekijä AP-1 ja sen aktiivisuus eivät ole AOX:n suora kohde, vaan AOX:lla on mahdollisesti suora yhteys JNK-reitin toimintaan jotakin muuta kautta.

Huolimatta siitä, että tietous AOX:n säätelymekanismeista eläimillä on puutteellista, kokeet useilla eri inhibiittoreilla viittasivat siihen, että AOX:n vaikutus solujen migraatioon todennäköisimmin selittyy spesifillä vaikutuksella aineenvaihduntaan; mahdollisesti entsyymin termogeenisellä toiminnalla. Kattavan kokonaiskuvan saaminen prosesseista, joiden kautta mitokondriaaliset häiriöt liittyvät solumigraatioon, tarjoaisi merkittävää lääketieteellistä tietoutta ja saattaisi jopa auttaa muun muassa syövän etäpesäkkeiden, kudosvaurioiden ja synnynnäisten keskilinjan kehityshäiriöiden hoitomuotojen kehittämisessä. Tarvitaan kuitenkin parempaa käsitystä mitokondrioiden osuudesta solusignaloinnissa, ja tämä on olennaista monien biologisten prosessien, sairauksien syiden ymmärtämisen ja kohdennettujen hoitojen suunnittelun kannalta.

Väitöskirjassani esitetyt tutkimustulokset tarjoavat uuden mallin, joka liittää mitokondrioiden toiminnan yksilönkehityksen aikaiseen solusignalointiin. Tuloksissani korostuu myös se, mitä voidaan oppia yhdistelemällä erilaisten mallien tarjoamaa tutkimustietoa ja -menetelmiä. Tässä tapauksessa Ciona intestinalis - vaippaeläimen käyttö auttoi ymmärtämään paremmin Drosophila melanogasterin monimutkaista yksilönkehitystä. Näiden tulosten pohjalta pystyin jatkamaan tutkimusta mitokondrioiden roolista solujen migraatiossa nisäkässolumallissa, millä on potentiaalisesti merkitystä ihmisen sairauksien tutkimisessa.

Cell migration is important in animal development, tissue repair, the functioning of the immune system and for tissue homeostasis in general. Impairments in cell migration are associated with various developmental abnormalities and pathologies. In Drosophila development, cell migration is instrumental during metamorphosis, in the process of thoracic closure. The most studied mammalian model of cell migration at the cellular level is the scratch or wound-healing assay, in which a linear scratch is made in a confluent monolayer of cells, which then migrate to close the gap.

The work presented in this thesis aims to understand how signaling associated with the mitochondrial respiratory chain affects cell migration in different models. As a tool to investigate this relationship, I used model organisms transgenically expressing the alternative oxidase, AOX, from a primitive marine animal, the tunicate Ciona intestinalis. AOX is an accessory component of the mitochondrial respiratory chain, which is found in microbes, plants, and some metazoan phyla, but not in vertebrates or insects. AOX directly oxidizes ubiquinol by molecular oxygen in a non-proton motive reaction, by-passing respiratory chain complexes III and IV. Utilizing AOX from Ciona intestinalis, I perturbed the mitochondrial respiratory chain and investigated the effect on developmental signaling affecting cell migration in the Drosophila and mammalian cell models. To create a control for these studies and test whether the ability of AOX to alleviate tested phenotypes depends on its enzymatic activity, I engineered a mutated variant of AOX in such a way as to abolish this activity.

I observed that co-expression of AOX from Ciona intestinalis was able to alleviate cleft thorax and other dysmorphic phenotypes in Drosophila, brought about by activated GeneSwitch transcription factor, which I hypothesize to interfere in some way with nuclear receptor signaling during development. Using the mutant AOX control, I was able to show that AOX enzymatic activity is instrumental in rescuing developmental lethality or locomotor dysfunction, resulting from cytochrome oxidase deficiency. I proceeded to use mutant AOX to show that the same is true for the rescue of the dysmorphic phenotypes induced by GeneSwitch.

AOX expression also alleviated the cleft thorax phenotype induced by genetic manipulations of the JNK signaling pathway, which regulates the formation of the dorsal thoracic epithelium and governs the migratory behavior of the cell sheets everting from the wing imaginal discs during metamorphosis.

Midline closure defects similar to cleft thorax in the fly are also seen in mammals, for example, in spina bifida, cleft lip and palate and cleft sternum. Considering the well conserved biology between fly and human and the highly conserved JNK signaling pathway, it was possible to use a mammalian cell-culture model to test the generality of the findings from Drosophila, as well as explore the molecular mechanisms underlying the influence of AOX on cell migration. I thus used the mammalian wound-healing model to confirm that AOX expression promotes migration in immortalized (but not primary) mouse embryonic fibroblasts, and rescues pharmacologically induced migration deficiencies through a mechanism involving JNK signaling. Reporter assays showed that AP-1 and its transcriptional activity are not a direct target of AOX. However the data suggest a possible direct involvement of JNK, acting through other targets.

Despite the lack of knowledge on how AOX is regulated in animals, the use of various inhibitors showed that the effect of AOX on cell migration is most likely due to a specific effect on metabolism, possibly due to its thermogenic activity. A full elucidation of the processes that link mitochondrial perturbations with cell migration should be of considerable medical importance and might even enable the design of new and more effective treatments, e.g., for metastatic tumors, tissue injuries, and congenital midline closure defects. A better understanding of the role mitochondria play in mediating cellular signaling is still needed, and will be instrumental to fully understand many fundamental biological processes, causes of disease and enable the design of precision treatments.

Results from this thesis provide us with a new paradigm linking mitochondrial function with developmental cell signaling. They also highlight what can be learned by combining tools and findings from different model organisms. In this case, the tunicate Ciona intestinalis provided a tool to better understand complex developmental processes in Drosophila melanogaster, which was then followed up in mammalian cells with potential relevance to human diseases.