Antimicrobial Detection Illuminated: Developing Bioluminescent Antibiotic Biosensors Based on Bacterial Gene Regulatory Elements

Abstract

Ever since World War II, antibiotics have been medicine’s number one asset in fighting microbial infection, one of the leading causes of death worldwide. Misuse of antibiotics has, however, led to rapid spread of antibiotic resistance among bacteria and ensuing development of multiple resistant pathogens. Therefore, antibiotics are rapidly losing their antimicrobial value, which can be seen a failure of society to protect one of its valuable resources.<br/><br/>The use of antibiotics in food production animals is strictly controlled by the European Union. Veterinary use is regulated to prevent spreading of resistance due to unwarranted use and to prevent antibiotic residues in food products. EU legislation establishes maximum residue limits (MRLs) of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin, and enforces countries to establish and execute a national monitoring plan of animal products to implement food control measures. Among samples selected for monitoring, suspect noncompliant samples are screened for and then subjected to confirmatory analysis to establish the identity and concentration of the contaminant. Screening methods for antibiotic residues are typically based on microbiological growth inhibition, whereas physico-chemical methods are used for confirmatory analysis.<br/><br/>In this study, antibiotic whole-cell biosensor assays were examined as a novel screening method. Utilizing a tetracycline-specific bioluminescent whole-cell biosensor, a screening method for tetracycline residues in poultry meat was developed. Assay sensitization to meet the EU MRLs was achieved by improving tetracycline accumulation into the biosensor cells with a combination of membrane-permeabilizing agent polymyxin B and chelating agent EDTA. The result was a rapid, simple and cost-effective high-throughput screening method that could detect all four veterinary relevant tetracyclines and their 4-epimer metabolites in poultry meat with sensitivity below the MRLs. The study also provided proof of antimicrobial activity of tetracycline 4-epimer metabolites, a quality previously thought absent from 4-epidoxycycline.<br/><br/>Nisin is a lantibiotic, a peptide antibiotic produced by lactococci. The industrial use of nisin as a food preservative (E234) and maximum allowed levels set by the EU warrant developing methods for nisin quantification in foods. In this study, a bioluminescent whole-cell biosensor for nisin was constructed and utilized in determining nisin concentrations in milk. The developed assay was rapid and simple to perform, and required no sample pretreatment except dilution. Sensitivity of the assay was in the sub-picogram per ml level, exceeding the performance of all previously published methods. The assay was also used in determining nisin-production efficiency by quantifying nisin in growth medium of a nisin-producing Lactococcus strain. Simultaneously, nisin producers could be distinguished from non-producers. This idea was expanded in a follow-up study, which utilized the nisin biosensor in screening for nisin producers in raw milk. Screening was based on simple overlay of raw milk cultures and identification of nisin producers by a bioluminescent zone surrounding the nisinogenic colony. The seven identified nisinogenic colonies were divided in three groups by genetic fingerprinting,and characterized as nisin variant Z producing Lactococcus lactis subsp. lactis. In addition, four nisin A producers were identified in a panel of 91 dairy lactococcal strains. Specificity studies showed that only nisin and not other bacteriocin peptides induced bioluminescence in the sensor strain. Also, all nisin-gene harboring colonies induced bioluminescence, with the exception of one lactococcal strain shown to carry a nonfunctional nisin gene.<br/><br/>The development of novel inducible whole-cell biosensors for different groups of antimicrobials can be limited by the lack of regulatory elements specifically responsive for these substances. In this study, we characterized DNA and ligand binding of the macrolide antibiotic-responsive repressor protein, MphR(E). The protein was modified by rational design of mutations to improve DNA affinity and dimerization. DNA and ligand binding as well as macrolide-induced dissociation from DNA were studied by fluorescence anisotropy and mass spectrometry. Mutants with improved DNA affinity and retained ligand binding and dissociation characteristics were identified. One mutant surprisingly formed a covalent dimer through disulfide bridge formation. This was shown to improve DNA affinity, but ligand binding and induction was impaired. Ligand binding spectrum of MphR(E) was shown to cover macrolides with a 14-membered lactone ring structure, but macrolides with a 16-membered ring or lincosamides showed no binding. MphR(E) and its mutants showed interesting novel characteristics that could benefit biosensor design.<br/><br/>In conclusion, this study shows the applicability of whole-cell biosensors in developing simple, robust and cost-effective screening methods for antimicrobials in food products. These methods show high sensitivity and specificity towards the target analyte, and can be used in semi-quantitative to quantative analysis. In addition to residue monitoring, whole-cell biosensors can be used for producer identification. The identified nisin producers can find use as protective starter cultures in fermented food production. The modified repressor MphR(E) shows promise as an improved regulator of reporter gene production in whole-cell biosensor applications, and is an example of purposeful effort to develop regulatory elements for novel biosensor designs.

Antibiootit ovat olleet tärkein bakteeri-infektioiden hoitokeino aina toisesta maailmansodasta lähtien. Bakteeri-infektiot ovat maailmanlaajuisten kuolemansyytilastojen kärkisijoilla. Antibioottien huolimaton käyttö on kuitenkin johtanut antibioottiresistenssin nopeaan leviämiseen bakteerien keskuudessa sekä useille antibiooteille resistenttien patogeenien kehittymiseen. Tämän vuoksi antibiootit menettävät nopeasti antimikrobiaalista voimakkuuttaan, mitä voidaan pitää yhteiskunnan kyvyttömyytenä suojella arvokasta pääomaansa.

Euroopan Unioni valvoo antibioottien käyttöä eläimissä, joita hyödynnetään elintarvikkeiden tuotannossa. Eläinlääketieteellistä käyttöä säädellään resistenssin leviämisen ja ruoassa esiintyvien antibioottijäämien estämiseksi. EU:n lainsäädäntö osoittaa enimmäisjäämärajat eläinlääkinnällisille aineille eläinperäisissä elintarvikkeissa ja velvoittaa jäsenvaltiot laatimaan ja toteuttamaan eläimistä saatavien elintarvikkeiden kansallisen vierasainevalvontaohjelman. Valvontaan valittujen näytteiden joukosta seulotaan näytteet, joiden epäillään sisältävän jäämiä, joiden luonne ja pitoisuus varmistetaan lisäanalyysillä. Seulonnassa käytetään tavallisesti mikrobiologiseen kasvuinhibitioon perustuvia menetelmiä, ja varmistukseen fysikaalis-kemiallisia analyysejä.

Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin kokosolubioantureilla tehtävien antibioottimääritysten soveltuvuutta antibioottijäämien seulontamenetelmäksi. Tetrasykliinispesifistä bioluminoivaa kokosolubiosensoria käyttäen kehitettiin seulontamenetelmä tetrasykliinijäämien tunnistamiseksi kananlihasta. Määritys saatiin herkistettyä EU:n enimmäisjäämärajojen tasolle helpottamalla tetrasykliinien pääsyä bioanturisoluun solukalvon läpäisykykyä lisäävällä polymyksiini B:llä sekä kahdenarvoisia kationeja kelatoivalla EDTA:lla. Tuloksena oli nopea, yksinkertainen ja kustannustehokas seulontamenetelmä, jolla oli korkea suoritusteho. Menetelmä kykeni havaitsemaan kaikki neljä eläinlääketieteessä käytettävää tetrasykliiniä sekä niiden 4-epimeeri aineenvaihduntatuotteet kananlihassa enimmäisjäämärajat alittavissa pitoisuuksissa. Tutkimus myös tuotti todisteita tetrasykliinien 4-epimeerien antimikrobiaalisesta aktiivisuudesta, joka aiemmin arveltiin puuttuvan 4-epidoksisykliiniltä.

Nisiini on laktokokkien tuottama lantibiootti eli peptidiantibiootti. Nisiinin käyttö elintarviketeollisuudessa säilöntäaineena (E234) sekä EU:n nisiinille asettama sallittu enimmäismäärä elintarvikkeissa luovat tarpeen nisiinin määritysmenetelmille. Tässä tutkimuksessa rakennettiin bioluminoiva nisiinispesifinen kokosolubioanturi, jota käytettiin määrittämään nisiinipitoisuuksia maidossa. Kehitetty määritys oli nopea ja yksinkertainen, eikä vaatinut laimennusta monimutkaisempaa näytteen esikäsittelyä. Määrityksen herkkyys oli alle pg/ml mittaluokassa, ja se oli herkin koskaan julkaistu nisiinimääritys. Määritystä käytettiin myös nisiinintuotannon tehokkuuden arvioinnissa mittaamalla nisiinipitoisuus sitä tuottavan Lactococcus lactis -kannan kasvumediumista. Samanaikaisesti nisiinintuottaja voitiin erottaa nisiiniä tuottamattomista kannoista. Tätä ajatusta tarkasteltiin laajemmin jatkotutkimuksessa,jossa nisiinibioanturia käytettiin seulomaan nisiinintuottajakantoja raakamaidosta. Yksinkertainen seulontamenetelmä perustui raakamaitobakteerien viljelmien peittämiseen ohuella bioanturikerroksella, jolloin nisiinintuottajapesäkkeiden ympärille muodostui biolumine-senssivyöhyke. Seitsemän tunnistettua nisiinintuottajapesäkettä jakautuivat geneettisen sormen-jäljen perusteella kolmeen ryhmään, ja ne olivat kaikki Lactococcus lactis subsp. lactis -alalajiin kuuluvia nisiini Z -variantin tuottajia. Lisäksi 91 laktokokkikannan paneelista tunnistettin kolme nisiini A -variantin tuottajaa. Spesifisyystutkimukset osoittivat, että vain nisiini indusoi bioluminesenssin bioanturibakteerissa eivätkä muut bakteriosiinipeptidit. Lisäksi kaikki nisiinigeeniä kantavat pesäkkeet indusoivat bioluminesenssin. Poikkeuksena oli yksi laktokokkikanta, jonka todettiin kantavan toimimatonta nisiinigeeniä.

Tietyille antibioottiryhmille spesifisen vasteen antavien säätelyelementtien puute saattaa vaikeuttaa kokosolubioanturien kehittämistä. Tässä tutkimuksessa karakterisoitiin makrolidispesifisen repressoriproteiini MphR(E):n DNA- ja ligandinsitomisominaisuuksia. Proteiinia muokattiin rationaalisen mutaatiosuunnittelun keinoin tarkoituksena tuottaa DNA- ja dimerisoitumisominaisuuksiltaan parempia mutantteja. DNA- ja ligandisitoutumista sekä makrolidiligandien indusoimaa dissosiaatiota DNA:sta tutkittiin fluoresenssianisotropialla ja massaspektrometrialla. Tutkimuksessa löydettiin mutantteja, joilla oli villityypin proteiinia parempi DNA-affiniteetti sekä ennallaan säilynyt kyky sitoa ligandeja ja indusoitua sitomisen vaikutuksesta. Yksi mutanteista muodosti rikkisillan avulla kovalenttisen dimeerin vastoin odotuksia. Kovalentti dimerisaatio paransi DNA-affiniteettia, mutta haittasi ligandin sitomista sekä induktiota. MphR(E):n ligandikirjo kattoi 14-jäsenisen laktonirenkaan makrolidit, mutta ei 16-jäsenisen renkaan makrolideja eikä linkosamideja. MphR(E) ja sen mutantit osoittivat mielenkiintoisia uusia ominaisuuksia, jotka voivat hyödyttää bioantureiden suunnittelua.

Johtopäätöksenä voidaan sanoa, että tämä tutkimus osoittaa kokosolubioanturien soveltuvan yksinkertaisten, luotettavien ja kustannustehokkaiden seulontamenetelmien kehittämiseen antibioottijäämien osoittamiseen elintarvikkeista. Nämä menetelmät osoittavat suurta herkkyyttä ja spesifisyyttä analyyttimolekyyliä kohtaan, ja niitä voidaan käyttää semikvantitatiiviseen sekä kvantitatiiviseen analysiin. Jäämien havainnoinnin lisäksi bioantureita voidaan käyttää antimikrobiaalisten aineiden tuottajien tunnistamiseen. MphR(E)-mutantit ovat lupaavia paranneltua säätelykykyä osoittavia reportterigeenin tuoton repressoreita käytettäväksi bioanturisovelluksissa. Ne ovat myös esimerkki rationaalisesta säätelyelementtien parantelusta uusien bioanturisovellusten kehittämiseksi.