Human In Vitro Vascularization, Adipocytes and Vascularized Adipose Tissue : Three relevant models for studies of vascularization, adipocytes and their interaction

Abstract

Rasvakudos on verisuonitettu endokriininen kudos. Kasvavan liikalihavuusepidemian takia rasvakudoksen toiminnan ja aineenvaihdunnan sekä näiden häiriötilojen tutkiminen ja rasvakudokseen vaikuttavien aineiden tunnistaminen on noussut entistä tärkeämmäksi tutkimusaiheeksi. Verisuonituksen ja rasvakudoksen toimintaan ja määrään pyritään tietoisesti vaikuttamaan lääkkeillä. Lääkkeiden toiminta täytyy osoittaa ennen kuin lääkkeet päätyvät markkinoille. Elinympäristössä on myös kemikaaleja, joiden vaikutuksia rasvakudokseen ei ole tiedostettu. On tärkeää tunnistaa nämä obesogeenit sillä ne ovat erityisen haitallisia sikiöille ja kehittyville lapsille. Jotta nämä voidaan tunnistaa, tarvitaan luotettavia testisysteemejä. Rasvakudokseen liittyvät tutkimukset tehdään kuitenkin edelleen useimmiten eläimillä tai eläinsoluilla. Lajien väliset erot rasvakudoksen säätelyssä ovat kuitenkin huomattavia ja siksi tarvitaan solumalleja, jotka kuvaavat ihmisen biologiaa.

Tässä tutkimuksessa kehitettiin verisuonitettu rasvakudosmalli ihmisen soluista. Tutkimuksessa kehitettiin ensin erillään mahdollisimman luonnollisen kaltaiset in vitro verisuonet ja rasvasolut, jonka jälkeen nämä yhdistettiin verisuonitetuksi rasvakudokseksi. Verisuonten muodostumista varten kehitettiin seerumiton kasvatusliuos rasvan stroomasolujen ja napanuoran endoteelisolujen yhteisviljelmässä käytettäväksi (angiogeneesimalli). Seuraavaksi kehitettiin protokolla insuliiniherkkien rasvasolujen erilaistamiseksi rasvan stroomasoluista. Kolmannessa vaiheessa verisuonitus yhdistettiin rasvasoluihin yksinkertaisia menetelmiä käyttäen, jotta saatiin selville sopiva viljelyaika mallille, solujen siirrostusajankohta sekä erilaistuksen aikaansaavien kasvatusliuosten lisäysjärjestys verisuonitetun rasvamallin aikaansaamiseksi. Näitä parhaiksi havaittuja viljelyolosuhteita hyväksi käyttäen yhdistettiin luonnollisen kaltaiset verisuonet ja rasvasolut verisuonitetuksi rasvamalliksi. Tämän mallin ominaisuudet ja vaste kemikaaleille, myös insuliinille, tutkittiin ja varmistettiin, että malli ja sen toiminta ovat luonnollisen rasvakudoksen kaltaisia.

Tulokset osoittivat, että angiogeneesimalliin muodostui hyvä verisuoniverkosto, jossa suonissa oli endoteelikerros jota ympäröi tyvikalvo. Suonet olivat kolmiulotteisia putkia, joissa oli lumen ja soluväliaine ja perisyytit ympäröivät näitä suonia. Rasvasolut keräsivät rasvaa, ilmensivät kypsän rasvasolun geenejä ja reagoivat insuliiniin lipolyysin estymisellä ja glukoosin sisäänotolla. Verisuonitetussa rasvakudosmallissa olevat suonet olivat luonnollisten suonien kaltaisia, rasvasolut olivat edelleen kypsiä rasvasoluja ja malli reagoi insuliinille oikein. Verisuonituksen vaikutus rasvasoluihin nähtiin rasvasolujen nopeampana kypsymisenä ja parantuneena insuliiniherkkyytenä. Verisuonten nähtiin myös vaikuttavan kemikaalivasteisiin mallissa.

Kaikki kolme mallia, verisuonet, rasvasolut ja verisuonitettu rasva ovat itsenäisesti käytettäväksi soveltuvia malleja angiogeneesin ja adipogeneesin tutkimiseen. Verisuonitettua rasvakudosmallia voidaan käyttää laajasti rasvakudoksen tutkimiseen mm. toksikologian, lääkekehityksen ja solubiologian aloilla.

Adipose tissue is a highly vascularized endocrine tissue. Due to the ever growing problem of obesity, the interest in determining mechanisms behind adipose tissue imbalances and identifying substances causing metabolic disturbances in adipose tissue is increasing. There are several drug treatments targeting vasculature and/or adipose tissue currently available and constantly new ones being developed including cancer, eye condition, insulin sensitizing and obesity treatments. Hence drug development needs reliable and relevant models for development and testing of these treatments. In addition, more attention has been focused on chemicals in our living environment that inadvertently affect adipose tissue. These obesogens need to be identified as they are especially harmful to fetuses and children. In order to identify these, relevant test systems are needed. Most adipose tissue related research is still conducted on animals or animal cells. Due to the species-to-species differences in adipose tissue regulation, cell models depicting human biology are greatly needed.

The aim of this study was to develop an in vitro vascularized adipose tissue model. A bottom-up approach was utilized, first optimizing the building blocks for the model and then moving on to combining these components. First, serum-free induction medium was developed for induction of in vitro vascularization (i.e. angiogenesis model) in human adipose stromal cells (hASC) and human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) co-cultures. Second, a protocol for inducing insulin sensitive adipocytes from hASC was developed. In the third step, vasculature and adipocytes were combined using simplified induction protocols to provide a proof of concept model of vascularized adipose tissue and to determine the optimal culture time, timing of induction media, and timing of seeding of hASC and HUVEC. Finally, we combined the two optimal components, insulin sensitive adipocyte protocol and vasculature utilizing the culture set-ups that were found to be optimal for creating the vascularized adipose tissue model. We studied the predictivity of this model by exposing it to chemicals, including insulin, with known effects on adipose tissue, and compared responses to those found in literature.

Results showed that the angiogenesis model induced with this serum-free medium produced an extensive vascular network with morphology resembling vessels in vivo including the intact endothelial layer, basement membrane, 3D tubules with lumen, extracellular matrix proteins and surrounding pericytes. The adipocytes differentiated from hASC with the new protocol accumulated lipids, showed mature adipocytes markers and responded to insulin by lipolysis inhibition and glucose uptake. The vascularized adipose tissue model contained an in vivo-like vascular network and mature adipocytes that were responsive to insulin. The interaction of adipocytes with vascularization was seen to result in faster maturation of adipocytes and better insulin sensitivity. Also the impact of chemicals on vascularized adipose tissue was different than on adipocytes alone.

The angiogenesis model with serum-free induction and the insulin sensitive adipocyte model are relevant in vitro models that can be used independently for studying angiogenesis and adipogenesis. The combined model, vascularized adipose tissue model, is a useful tool for adipose tissue research, including toxicological, drug discovery and cell biology research applications.