Transcriptional regulation and cell signaling in acute lymphoblastic leukemia and hematopoiesis

Abstract

Leukemia kehittyy verisoluja muodostavassa kudoksessa ja sitä tavataan kaiken ikäisillä potilailla. Useat geneettiset ja epigeneettiset muutokset voivat aiheuttaa häiriöitä normaalien luuytimen varhaisvaiheen solujen erilaistumisessa, jakaantumisessa ja elinkyvyssä. Akuutit leukemiat voidaan jakaa myelooiseen ja lymfaattiseen tyyppiin riippuen siitä, mistä verisolulinjasta leukeemiset solut ovat saaneet alkunsa. Akuutit lymfaattiset leukemiat (ALL) voidaan puolestaan jakaa varhaisten B-solujen (B-ALL) tai T-solujen (T-ALL) leukemioihin. B-ALL-potilaille on tunnusomaisia erilaiset kromosomaaliset poikkeavuudet, joita voidaan käyttää myös ennusteellisina merkkeinä. T-ALL:ssa puolestaan tavataan aliryhmäkohtaisia geenien ilmentymismuutoksia. ALL on yleisempi lapsipotilailla ja tyypillinen esiintymispiikki ilmenee 2-5 vuoden iässä. Vaikka ALL-potilaiden selviytymisaste on parantunut huomattavasti viime vuosikymmeninä, on eri alityyppien välisissä ennusteissa edelleen merkittäviä eroja. Lasten ALL:ssa taudin uusiutuminen onkin yleisin syy hoidon epäonnistumiselle ja hidas alkuhoitovaste ennustaa tarkinten taudin uusiutumisriskiä.

Geenien ilmentymisen säätely ja solujen signalointi ovat merkittävässä roolissa solujen erilaistumisessa, sekä niiden elin- ja kasvukyvyssä. Tarkastelimme leukemioissa ja niiden alityypeissä poikkeavasti ilmentyneitä geenejä ja tunnistimme tällaisiksi PTP4A3 ja SOX11 geenit. PTP4A3 on fosfataasi, joka muokkaa kohdeproteiiniensa toimintaa fosforitähteen poistolla seriini-, treoniini- tai tyrosiiniaminohaposta. Kolmesta PTP4A proteiiniperheen jäsenistä PTP4A3 ilmentyi leukemiassa lähinnä ETV6-RUNX1- ja BCR-ABL1-alityypeissä. ETV6- RUNX1-proteiinifuusion todettiin säätelevän PTP4A3:n ilmentymistä, mutta solujen kasvukyvyssä ei havaittu merkittävää muutosta PTP4A3 geenin hiljentämisen tai proteiinin entsymaattisen aktiivisuuden estämisen seurauksena.

SOX11 on geenien ilmentymisen säätelytekijä (transkriptiotekijä), jonka toiminta on erityisen tärkeää aikaisessa sikiön kehittymisessä. SOX11 geenin ilmentymisen havaittiin olevan poikkeavaa ALL:n ETV6-RUNX1- ja TCF3-PBX1-alityypeissä. SOX11 geenin hiljentämisen seurauksena havaittiin ilmentymisen muutoksia geeneissä, jotka liittyvät solujen kiinnittymiseen, liikkumiseen ja erilaistumiseen. SOX11 geenin korkea ilmenemistaso oli yhteydessä SOX11 geenialueen vähäiseen metylaatiotasoon ja parempaan kliiniseen ennusteeseen. Tulokset viittaavat siihe, että SOX11 proteiinia voitaisi hyödyntää hyväennusteisen potilasryhmän tunnistamisessa.

T-ALL:n ennuste on parantunut viimeisen vuosikymmenen aikana, mutta taudin uusiutuessa potilaiden selviytymisennuste on heikko. Laajalle, 4430 leukemianäytettä sisältävälle aineistolle tehdyllä in silico-lääkeaineseulonnalla pyrittiin löytämään uusia kohdennettuja T-ALL:n lääkehoitoja. Lääkeaineseulonnassa yhdistettiin leukemiassa tavattujen geenien ilmentyminen lääkeaineen kohdegeenien ilmentymiseen. Tuloksena havaittiin Src proteiiniperheeseen kuuluvan tyrosiinikinaasin, LCK:n, voimakas ilmentyminen, jolle lääkeaineseulonnan perusteella mahdolliseksi kohdennetuksi lääkkeeksi soveltuisi dasatinib. In vitro- ja ex vivo-kokeet solulinjoilla ja potilasnäytteillä vahvistivat dasatinibin tehon noin 30 %:lla tutkituissa tapauksissa. Tulokset viittaisivat siihen, että dasatinibin käyttöä T-ALL:ssa kannattaa selvittää jatkotutkimuksilla.

SAP30L (Sin3A-associated protein 30-like) proteiini kuuluu Sin3Aproteiinikompleksiin, joka toimii pääasiassa geenien ilmentymisen hiljentäjänä stabiloimalla joko proteiini-proteiini tai proteiini-DNA interaktioita. Seeprakala (Danio rerio) ilmentää vain SAP30L proteiinia (eikä sukulaisproteiini SAP30:ta), mikä tekee siitä erinomaisen valinnan tutkittaessa kyseisten proteiinien toimintaa. Seeprakalassa SAP30L ilmentyy kaikkialla sekä poikasvaiheen että aikuisen yksilön kudoksissa. Morfoliino-välitteisen SAP30L-geenin hiljentämisen seurauksena havaittiin muutoksia sydämen morfologiassa sekä hemoglobiinitasoissa. DNAmikrosiruanalyysi osoitti SAP30L-morfanteissa ilmentymisen heikentymistä sydänspesifisessä nkx2.5. geenissä, sekä hemoglobiinisynteesin ja punasolujen kehittymisen kannalta tärkeissä geeneissä. Tulokset osoittavat SAP30L säätelevän sydämen kehittymistä sekä punasolujen muodostumista seeprakalassa.

Tässä väitöskirjassa löydettiin uusia leukemian ja verenmuodostuksen geenien ilmentymisen säätelytekijöitä (SOX11, SAP30L) sekä poikkeava ilmentyminen solusignaloinnin (PTP4A3) säätelyproteiinissa. Lisäksi tutkimuksissa tunnistettiin uusi mahdollinen täsmälääkehoito T-soluiseen akuuttiin leukemiaan.

Leukemia originates from blood-forming tissue and it occurs in people of all ages. Various genetic and epigenetic alterations drive the malignant transformation of progenitor cells resulting in aberrant cell proliferation, lack of differentiation and extended survival. Acute leukemias can be divided into either myeloid or lymphoid diseases, based on the blood cell lineage from where the leukemic cells arise. Based on the malignant precursor from where acute lymphoblastic leukemia (ALL) originates, ALLs can be further subdivided into B cell precursor ALL (BCP-ALL) or T cell ALL (T-ALL) which often carry either chromosomal aberrations or distinct gene expression patterns. Unlike in BCP-ALL, distinct T-ALL subtypes do not serve as prognostic markers. ALL is more common in pediatric patients, with the peak incidence at 2-5 years of age. ALL survival in pediatric patients has improved significantly during the last decades but there is still prognostic variation across subtypes so that some subtypes carry higher relapse risk. Relapse remains the most common treatment failure in pediatric ALL and the poor response to early therapy is the strongest predictor of relapse risk.

Transcriptional regulation of gene expression and cell signaling are critical players in cell differentiation, proliferation and survival. We sought to identify aberrantly expressed genes that show subtype-specific expression in ALL. Among these were PTP4A3 and SOX11. PTP4A3 is a dual-specificity phosphatase that can inactivate targets by dephosphorylating either serine, threonine or tyrosine residues. From the three PTP4A family members, PTP4A3 demonstrated a subtype-specific expression in ETV6-RUNX1 and BCR-ABL1 acute leukemias. We showed that ETV6-RUNX1 fusion regulated PTP4A3 expression but no marked changes were seen in cell viability after knockdown of PTP4A3 gene or inhibition of its enzymatic activity. Developmental and neuronal transcription factor SOX11 was aberrantly expressed in ETV6-RUNX1 and TCF3-PBX1 subtypes of BCP-ALL. Knockdown of SOX11 led to alteration in the expression of genes typically associated with cell adhesion, migration and differentiation. High SOX11 expression was associated with DNA hypomethylation at SOX11 locus and favourable clinical outcome. These results indicate that SOX11 expression marks a group of patients with good outcome and encourage further studies of its use as a prognostic biomarker.

The prognosis of T-ALL has also improved during the last decade, but when relapsed, T-ALL patients rarely survive. We performed in silico drug screening across 4430 leukemia samples in order to find novel targeted therapies for T-ALL by matching leukemia gene expression data with drug target gene expressions. As a result, strong expression of LCK, a Src family tyrosine kinase, was detected in TALL samples and in silico screening suggested dasatinib as a targeted therapy. This was confirmed by in vitro and ex vivo experimental studies in cell lines and patient samples where 30 % of the studied cases showed a response to dasatinib, suggesting the potential of dasatinib drug in the treatment of T-ALL patients.

Finally, we studied the Sin3A-associated protein SAP30L, which is part of the Sin3A corepressor complex and regulates gene expression by stabilizing proteinprotein and protein-DNA interactions. Zebrafish (Danio rerio) was chosen as a model organism for studying the role of SAP30L as it only expresses SAP30L and not SAP30. SAP30L showed ubiquitous expression in both embryonic and adult zebrafish tissues, and morpholino-mediated SAP30L knockdown resulted in cardiac abnormalities and reduced hemoglobin levels of red blood cells. A microarray analysis of SAP30L morphant gene expression revealed down-regulation of the heart-specific nkx2.5 gene and genes important for hemoglobin synthesis and erythropoiesis. Results demonstrated that SAP30L regulates cardiac development and erythropoiesis in zebrafish.

In conclusion, this thesis identifies novel regulators of transcription (SOX11, SAP30L) and cell signaling (PTP4A3) in acute leukemia and hematopoiesis, and discover a novel potential targeted therapy for a subgroup of T-ALL patients.