Modelling Arrhythmias and Drug Responses in CPVT Patient-Specific hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Abstract

Indusoituja pluripotentteja kantasoluja (iPS-solut) voidaan valmistaa ottamalla koepala ihosta ja geenimanipulaatiomenetelmin siirtää niihin neljä tärkeää transkriptiotekijää: Oct3/4, Sox2, Klf4 ja c-Myc. iPS-soluja voidaan erilaistaa edelleen eri solutyypin soluiksi, kuten sydänsoluiksi. iPS-sydänsolut kantavat mukanaan samaa geneettistä informaatiota kuin organismi josta koepala oli alun perin otettu. Näin ollen eri sairauksia sairastavien potilaiden ihon koepaloista voidaan valmistaa heidän sairautensa tekijöitä kantavia sydänsoluja yksilöityä lääketiedettä ja lääketutkimusta varten. Tämän solumallin avulla voidaan vähentää eläinkokeita, jotka muutenkaan eivät aina täysin vastaa fysiologisilta olosuhteiltaan ihmiskehon vastaavia.

Katekoliamiiniherkkä polymorfinen kammiotakykardia (CPVT) on suhteellisen harvinainen mutta hengenvaarallinen perinnöllinen rytmihäiriösairaus muuten rakenteellisesti normaalissa sydämessä. CPVT:aa sairastaa noin yksi kymmenestätuhannesta. Potilailla on suurentunut äkkikuoleman riski ja joka kolmas hoitamattomista kuolee 30.:een ikävuoteen mennessä. Rytmihäiriöt ja äkkikuolemat aiheutuvat ryanodiinireseptorin (RYR2) mutaatioista johtuvasta epänormaalista toiminnasta fyysisen tai psyykkisen stressin aiheuttaman adrenergisen stimulaation aikana. RYR2 on ionikanava solunsisäisen kalsiumvaraston, sarkoplasmakalvoston, kalvolla ja jonka spontaanit kalsiumpurkaukset voivat johtaa rytmihäiriöihin ja äkkikuolemaan. Tästä johtuen CPVT potilaiden on vältettävä liikuntaa ja jännittäviä tilanteita jossa heidän hormonaalinen stimulaationsa voi laukaista näitä tapahtumia sydänsoluissa.

Beetasalpaajia käytetään yleisesti CPVT potilaiden hoidossa. Ne ovat lääkkeitä jotka estävät β-adrenergisen stimulaation sydänsoluissa salpaamalla adrenaliinireseptoreita. Kaikilla potilailla ei kuitenkaan päästä toivottuun hoitovasteeseen. Karvediloli ja flekainidi ovat mahdollisia vaihtoehtoisia lääkkeitä CPVT:n hoitoon, sillä niiden on todettu vaikuttavan RYR2:n toimintaan. Näillä lääkkeillä on siten mahdollisesti rytmihäiriöitä estäviä vaikutuksia sydänsoluissa. Tämä väitöskirjatyö keskittyy CPVT potilaista tuotetuista iPS-soluista erilaistettujen sydänsolujen tutkimiseen. Työssä verrataan eri CPVT potilaista tuotettujen sydänsolujen elektrofysiologisia ominaisuuksia ja haetaan vastauksia tautimekaniikkaan. Lisäksi tutkitaan karvedilolin ja flekainidin vaikutuksia näissä soluissa. Tuloksia verrataan terveen henkilön iPS-sydänsoluihin ja niiden vasteisiin. Ensimmäisessä osatyössä tutkittiin CPVT sydänsolujen kalsiumaineenvaihduntaa kalsiumkuvantamismenetelmällä. Rytmihäiriöitä indusoitiin adrenaliinilla ja rytmihäiriöitä ja niiden frekvenssiä tutkittiin ennen ja jälkeen lääkkeiden annostelua. Toisessa osatyössä tutkittiin miten normaalien iPS-sydänsolujen solukalvon sähköiset ominaisuudet ja sisäinen kalsiumaineenvaihdunta korreloivat keskenään normaalissa sekä rytmihäiriöisessä toiminnassa. Solukalvon sähköinen signaali, aktiopotentiaali, johtaa sydänsolujen kalsiumaineenvaihduntaa ja supistumista. Työssä käytettiin klassista elektrofysiologian patch clamp -menetelmää, jolla voidaan määrittää solukalvon jännite-eroja sekä ionien johtavuutta, yhdistettynä edellisessä osatyössä käytettyyn kalsiumkuvantamismenetelmään. Kolmannessa osatyössä tutkittiin taas karvedilolin ja flekainidin vaikutuksia CPVT solujen rytmihäiriöihin, mutta nyt patch clamp- ja videokuvantamismenetelmien avulla. Videolle voidaan tallentaa sydänsolujen supistumisliike, joka voidaan analysoida tietokoneohjelmalla. CPVT solujen elektrofysiologisia- ja supistusominaisuuksia tutkittiin ja vertailtiin eri tilanteissa, adrenaliinin ja lääkkeiden vaikutuksen aikana.

Tämän väitöskirjatyön tulokset osoittavat, että iPS-soluista johdetut sydänsolut toimivat tautimallina ja lääketutkimuksen alustana. Tulevaisuudessa tämän työn tapaisten mallien avulla päästään mahdollisesti lähemmäksi yksilöityä lääketiedettä ja hoitoa CPVT potilaiden osalta. Lisäksi tässä työssä selvitimme sydänsolujen toiminnallisuuden kannalta tärkeiden ominaisuuksien yhteyttä toisiinsa eri menetelmin.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated in a laboratory environment from skin fibroblasts or other fully differentiated cells by introducing them to four key factors: Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc. Human iPSCs can be further differentiated into beating cardiomyocytes (CMs). These hiPSC-derived CMs carry the same genome as the individual from which they were generated. The technique provides an endless source of cardiomyocytes for patient-specific disease modelling and treatment optimization for personalized medicine. In addition, preclinical animal models, which fail to recapitulate human physiology, could be replaced by hiPSC-derived CMs in drug development.

Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) is a severe inherited cardiac arrhythmia in structurally normal hearts that is associated with an increased risk of sudden cardiac death. The prevalence of CPVT is approximately 1:10,000, and the mortality rate without treatment is around 35% by the age of 30. Patients with CPVT experience arrhythmias during exercise or emotional stress. Most CPVT cases are caused by mutations in the gene coding for the cardiac ryanodine receptor RYR2, which releases calcium ions from intracellular storage. Increased plasma levels of adrenaline during stress cause spontaneous calcium leakage through RYR2 and lead to arrhythmias. Therefore, patients with CPVT cannot exercise and must avoid situations of excitement.

Beta-blockers are commonly used in the treatment of CPVT. These compounds block the adrenergic receptors and thus inhibit the effect of adrenaline. However, these drugs do not provide complete protection against potentially lethal arrhythmias. Carvedilol, a non-selective beta-blocker, and flecainide, a sodium channel blocker, have been investigated as alternative options since they have been shown to have a direct effect on RYR2. These drugs could have an antiarrhythmic effect on RYR2 and serve as therapeutic options.

This dissertation focuses on hiPSC CMs derived from CPVT patients carrying different mutations in RYR2 for the purpose of testing the antiarrhythmic potential of carvedilol and flecainide. In the first study, hiPSC CMs were studied by calcium imaging. Basic characteristics and the incidence of arrhythmias caused by exposure to adrenaline were assessed in CPVT and control CMs. In addition, the antiarrhythmic efficacy of carvedilol and flecainide in abolishing these arrhythmias was investigated. The second study focused on revealing the correlation between calcium and the membrane voltage of the hiPSC CMs during arrhythmias by conducting simultaneous patch clamp and calcium imaging. Changes in membrane voltage drive the eruption of calcium inside CMs and lead to the contraction of the cardiac muscle. The aim was to investigate how the two signals differ from each other under these conditions. In the third study, the effects of carvedilol and flecainide on the membrane voltage and contraction of CPVT and control CMs was studied, along with the drugs’ antiarrhythmic efficacy. Furthermore, the correlation between the membrane voltage and contraction was assessed by conducting simultaneous patch clamp and video imaging.

The results of this dissertation highlight the usefulness of hiPSC CMs as a model for disease modelling and drug screening. In the future, studies based on these models could be used to establish personalized treatment. Furthermore, the research sheds light on the correlation between different aspects of excitation contraction coupling that are essential in arrhythmogenesis.