Molecular detection of enteroviruses in cell and tissue samples : Implications in type 1 diabetes

Abstract

Tyypin 1 diabetes on sairaus, johon ei ole parannuskeinoa eikä ennaltaehkäisevää hoitoa. Tyypin 1 diabeteksessa insuliinia tuottavat haiman beetasolut ovat vaurioituneet tai tuhoutuneet kroonisen autoimmuuniprosessin seurauksena, mikä johtaa elinikäisen insuliinihoidon tarpeeseen. Geneettinen alttius määrittelee taipumuksen sairastua, mutta tämän lisäksi tarvitaan ympäristötekijöiden vaikutus. Esimerkiksi lukuisat epidemiologiset tutkimukset ovat liittäneet enterovirusinfektiot tyypin 1 diabetekseen. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää ja vertailla menetelmiä, joilla pystytään tunnistamaan enterovirus solu- ja kudosnäytteistä. Lisäksi tavoitteena oli soveltaa näitä menetelmiä diabeetikoiden ja esidiabeetikoiden kudosnäytteiden analysointiin enterovirusten osuuden selvittämiseksi tyypin 1 diabeteksen tautiprosessissa.

Kaupallista in situ hybridisaatio-teknologiaa käytettiin enteroviruksen genomin paikallistamiseen formaliinilla fiksatuista ja parafiiniin valetuista (FFPE) kudosleikkeistä. Enterovirukselle spesifisiä ja viruksen genomin tunnistavia koettimia suunniteltiin ja niiden toimivuus testattiin eri enteroviruksilla infektoiduilla soluviljelynäytteillä ja infektoitujen hiirten kudosnäytteillä. Menetelmä pystyi toteamaan viruksen näistä näytteistä ja tunnistuksen tarkkuutta voisiin säädellä koettimien sekvenssiä muuntelemalla siten, että menetelmä tunnisti joko laajakirjoisesti monia eri enteroviruksia tai vain yhtä enteroviruksen alatyyppiä.

Eri enteroviruksen tunnistusmenetelmien keskinäinen vertailu viruksella infektoitujen humaanisolujen laimennossarjassa (jää- ja FFPE –näytteet) osoitti, että jäänäytteissä herkimmät menetelmät olivat RT-qPCR tunnistaen enteroviruksen laimeimmastakin näytteestä (10-8) ja proteomiikka (10-7). Immunohistokemia kaupallisella enterovirus VP1-vasta-aineella tunnisti enteroviruksen FFPE-näytteistä 10-6 laimennoksesta ja ISH puolestaan 10-4 laimennoksesta.

RT-qPCR:ää ja immunohistokemiaa käytettiin Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) -projektin kudoskokoelman analysointiin seuraavista elinluovuttajaryhmistä: tyypin 1 diabeetikot (T1D), autovasta-ainepositiiviset esidiabeetikot (AAb+) ja elinluovuttajat, joilla ei ollut diabetesta (verrokit). Parafiinileikkeitä haimasta, pernasta, ohutsuolesta ja haiman imusolmukkeista värjättiin kaupallisella enterovirus VP1-vasta-aineella. Värjäykset osoittivat, että enteroviruksen proteiinia löytyy diabeetikoiden kudoksista useammin kuin verrokkien; haimassa 70 % vs. 33 % (vain insuliinipositiiviset elinluovuttajat laskettu mukaan), ohutsuolessa 40 % vs. 14 % ja pernassa 40 % vs. 26 %. Haiman imusolmukenäytteitä analysoitiin vain 10 elinluovuttajalta (9 T1D ja 1 AAb+) ja näistä 56 % ja 100 % oli enterovirus-positiivisia. Lisäksi samoista kudoksista analysoitiin jäänäytteitä RT-qPCR:llä enteroviruksen genomin tunnistamiseksi. Enteroviruksen RNA:ta löydettiin kaikista muista kudoksista paitsi ohutsuolesta, mutta selvästi harvemmin kuin enteroviruksen proteiinia. Kun enteroviruspositiivisia haimanäytteitä värjättiin vasta-aineilla, jotka tunnistavat virusinfektiovasteeseen liittyviä soluproteiineja isäntäsoluissa (HLA I, MxA ja PKR), huomattiin, että diabeetikoiden enterovirus-positiiviset saarekkeet ilmensivät voimakkaasti HLA I:stä ja MxA:ta. Verrokeiden enterovirus-positiivisissa saarekkeissa näiden markkereiden ilmentyminen oli normaalia. Tämän perusteella voidaan spekuloida, että virusinfektion aikaansaamat sytokiinivasteet poikkeavat eri ryhmien välillä.

Yhteenvetona, työssä kehitettiin enteroviruksen RNA:ta solu- ja kudosnäytteistä tunnistava in situ hybridisaatiomenetelmä. Menetelmän kykyä tunnistaa eri enterovirustyyppejä pystyttiin säätelemään koettimien sekvenssiä muuntelemalla. Menetelmän herkkyys ei kuitenkaan ollut riittävä viruksen tunnistamiseksi humaanikudosnäytteestä, jossa viruksen määrä on alhainen. Diabeetikoiden ja verrokkien kudosnäytteitä analysoitaessa huomattiin, että enterovirukset ovat yleisempiä diabeetikoiden kudoksissa kuin verrokkien. Lisäksi, virus-RNApositiivisten näytteiden lukumäärä oli selvästi pienempi kuin virusproteiinille positiivisten määrä. Lisäksi erityisesti interferonivälitteiseen solujenväliseen vuorovaikutukseen liittyvät virusvastetta ilmaisevat merkkiaineet olivat infektoituneissa saarekkeissa diabeetikoilla selvästi enemmän koholla kuin verrokeilla, mikä saattaa osaltaan vaikuttaa taudin immuunivälitteiseen syntyyn.