Reverse Genetics to Study Immunity against Mycobacteria in Zebrafish (Danio rerio)

Abstract

Tuberculosis (TB) causes over a million mortalities annually. The disease is caused by the intracellular bacterial species Mycobacterium tuberculosis, and currently no completely preventive vaccination against the infection exists. Additionally, since the drug-sensitive TB is challenging to cure and the amount of drug-resistant M. tuberculosis strains is increasing, novel drug candidates against the disease need to be developed. The influence of the genetic variation of the host on the susceptibility against TB is well-established. Therefore, screening for novel candidate genes in a mycobacterial infection and studying them systemically in an appropriate model organism provides a powerful starting point for drug development.

With the advent of commercially available mutant zebrafish lines as well as efficient genome modification tools, such as the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9) system, the zebrafish provides an interesting genetically controllable alternative for studying gene specific effects in vivo. Furthermore, the zebrafish Mycobacterium marinum infection recapitulates several aspects of human TB, providing a safe and a cost-efficient model for studying mycobacterial pathogenesis. This study examined the genetic component of TB susceptibility using the zebrafish M. marinum infection model.

Specifically, the aims were: to set up an in-house CRISPR/Cas9 mutagenesis method in the zebrafish, and to verify that this system can be efficiently used to create targeted genomic mutations, as well as to study the roles of an important regulator of T cell function FURIN, and of microbial recognition proteins, Intelectins (ITLNs), in vivo in the zebrafish host response against mycobacteria.

Using a commercially available furinAtd204e zebrafish line, it was found that the expression levels of the T helper (Th) cell subtype specific transcription factors tbx21, gata3 and foxp3a were elevated in the furinAtd204e/+ mutant fish in steady state compared to the wild type (WT) fish. In addition, it was observed that the furinAtd204e/+ mutants had reduced furinA mRNA levels compared to the WT controls and that furinA expression was induced upon a mycobacterial challenge. Finally, we demonstrated that the furinAtd204e/+ mutant fish had an infectioninducible proinflammatory phenotype, characterized by the increased expression of tnfa, lta and il17a/f3, which was associated with a reduced mycobacterial burden in a chronic M. marinum infection.

Demonstrating that the CRISPR/Cas9 mutagenesis system is feasible in our hands, an enhanced green fluorescent protein gene (egfp) was efficiently mutated in a transgenic tg(fli1a:egfp) zebrafish line. Moreover, also the endogenous ca10a and ca10b genes could be modified in the zebrafish embryos using the CRISPR/Cas9 technology.

Based on a genome-wide gene expression analysis, intelectin 3 (itln3) was identified as one of the most up-regulated zebrafish genes in a M. marinum infection. Consequently, the CRISPR/Cas9 system was utilized to create itln3uta145 and itln3uta148 mutant zebrafish lines, and to characterize the effects of itln3 deficiency in a mycobacterial infection. Despite its strongly induced expression during an infection, itln3 was found dispensable for the protective immune response against M. marinum as was suggested by the comparable mycobacterial burden and survival of itln3 mutants and WT controls. Further studies are warranted to assess if FURIN and ITLN levels could be used as novel diagnostic measures in TB, and whether FURINinhibitors have the potential to be used as anti-mycobacterial drugs.

Tuberkuloosi aiheuttaa vuosittain yli miljoona kuolonuhria. Taudin aiheuttaja on solunsisäinen bakteeri Mycobacterium tuberculosis, eikä sen aiheuttamaa infektiota vastaan ole täysin estävää rokotetta. Koska tuberkuloosi-infektio on hankala parantaa nykyisillä lääkkeillä ja lääkeresistenssien M. tuberculosis -kantojen määrä on kasvussa, uusien tuberkuloosihoitojen kehittäminen on tarpeellista. Ihmisen geneettiset tekijät vaikuttavat tuberkuloosialttiuteen, minkä vuoksi uusien mykobakteeri-infektioon vaikuttavien geenien seulominen sekä niiden tutkiminen systeemisesti sopivissa malliorganismeissa toimii hyvänä lähtökohtana lääkekehitykselle.

Saatavilla olevien kaupallisten mutanttikalalinjojen ja tehokkaiden genominmuokkaustyökalujen, kuten clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9) -systeemin, vuoksi seeprakala (Danio rerio) on geneettisesti muokattavissa oleva vaihtoehto geenikohtaisten vaikutusten tutkimiseksi eliötasolla. Tämän lisäksi seeprakalan Mycobacterium marinum -infektio mallintaa useita piirteitä ihmisen tuberkuloosiinfektiosta, tarjoten turvallisen ja taloudellisen mallin mykobakteeripatogeneesin tutkimiseksi. Tässä tutkimuksessa selvitettiin tuberkuloosialttiuteen vaikuttavia geenejä käyttäen seeprakalan M. marinum -infektiomallia. Tutkimuksen tavoitteina oli pystyttää tiedekunnan sisäinen seeprakalan CRISPR/Cas9-mutageneesimenetelmä ja varmentaa, että menetelmällä voidaan tehokkaasti luoda kohdennettuja mutaatioita seeprakalan genomiin, sekä tutkia T-solujen toiminnalle tärkeää FURINsäätelyproteiinia ja mikrobien tunnistusproteiineja, Intelektiinejä, seeprakalan mykobakteeri-immuniteetissä.

Käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa furinAtd204e -seeprakalalinjaa, furinAtd204e/+ -mutanteilla osoitettiin olevan normaaliolosuhteissa yli-ilmentyneet auttaja-T-soluille tyypilliset transkriptiotekijät tbx21, gata3 ja foxp3a verrattuna villityypin kaloihin. Sen lisäksi furinAtd204e/+ mutanteilla havaittiin olevan alentuneet furinA-lähetti-RNA-tasot ja furinA-geenin olevan indusoitunut M. marinum -infektiossa. Osoitimme myös, että furinAtd204e/+ -mutanttikaloilla oli infektiossa lisääntynyt tulehdusvaste, jota kuvasti kasvaneet tnfa, lta ja il17a/f3 ilmentymistasot, ja joka assosioitui matalampiin mykobakteerimääriin kroonisessa infektiossa.

CRISPR/Cas9-menetelmän toimivuuden osoitimme mutatoimalla enhanced green fluorescent protein –geenin transgeenisessä tg(fli1a:egfp) seeprakalalinjassa. Tämän lisäksi onnistuimme CRISPR/Cas9-teknologian avulla muokkaamaan endogeeniset ca10a ja ca10b geenit seeprakalan alkioissa.

Pohjautuen genominlaajuiseen ilmentymisanalyysiin itln3-geenin havaittiin olevan eräs korkeimmin ilmentyneistä seeprakalan geeneistä M. marinum -infektiossa. Tästä johtuen CRISPR/Cas9-menetelmää käytettiin itln3uta145 ja itln3uta148 - mutanttiseeprakalalinjojen tuottamiseksi ja itln3-puutoksen vaikutuksen selvittämiseksi mykobakteeri-infektiossa. Huolimatta selkeästi kohonneesta ilmentymistasosta, itln3-geenin havaittiin olevan merkityksetön immuunivasteessa M. marinumia vastaan, sillä homotsygooteilla itln3-mutanteilla oli infektiossa verrattavissa olevat mykobakteerimäärät sekä selviytyminen villityypin kontrollikaloihin nähden. Lisätutkimuksia tarvitaan arvioimaan voitaisiinko FURINja ITLN-proteiinitasoja käyttää uusina diagnostisina mittareina tuberkuloosissa ja olisiko FURIN-inhibiittoreita mahdollista käyttää mykobakteerilääkkeinä.