Induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells : The lipid status in differentiation, functionality, and de-differentiation of hepatic cells

Abstract

Ihmisen maksasta eristettyjä soluja (PHH) pidetään ns. ”kultaisena standardina” maksan fysiologian, toksisuuden ja lipidien homeostaasin tutkimiseksi. Nämä solut ovat vaikeasti saatavia sekä toiminnoiltaan heterogeenisiä ja viljeltynä menettävät maksalle spesifit toiminnot suhteellisen nopeasti jo muutamassa päivässä. Uudelleen ohjelmoiduista kantasoluista (iPS-solut) tuotetut maksasolujen kaltaiset solut (HLC) tarjoavat vaihtoehtoisen mallin maksan normaalin ja poikkeavan rasvaaineenvaihdunnan tutkimiseksi. Näiden kantasoluista tuotettujen maksasolujen etuna on rajoittamaton saatavuus sekä mahdollisuus tuottaa niitä eri geenitaustan omaavien yksilöiden soluista. Koska rasva-aineenvaihdunnan häiriöillä on keskeinen rooli monien yleisten tautien kuten ei-alkoholiperäisen rasvamaksan sekä ateroskleroottisen sydän- ja verisuonitaudin patogeneesissä, kantasoluista tuotetut maksasolut tarjoavat uuden potilasspesifisen keinon rasva-aineenvaihdunnan ja sen häiriöiden perusmekanismien tutkimiseksi. Lisäksi tätä solumallia on mahdollista hyödyntää lääkekehityksessä ja erityisesti lääkkeiden aiheuttaman maksatoksisuuden tutkimisessa. Jotta näitä maksasoluja voidaan hyödyntää maksimaalisesti, on tärkeää selvittää niiden yksityiskohtainen lipidiprofiili ja verrata sitä ihmisen maksasta eristettyihin soluihin.

Rasvat ovat merkittävä molekyyliluokka, ja niillä on tärkeä tehtävä solun rakenteessa, toiminnassa ja signaloinnissa. On myös osoitettu, että tietyt rasvahapot edistävät hermo- ja rasvasolujen erilaistumista. Siksi maksasolujen lipidi- ja rasvahappoprofiilien muutoksien syvällinen tuntemus sekä erilaistumisen (differentiaation) että spesifisten ominaisuuksien vähenemisen (dedifferentiaation) aikana auttaisi meitä tuottamaan kantasoluista kypsiä maksasoluja, joiden lipidiprofiili muistuttaisi maksasta eristettyjen solujen lipidiprofiilia entistä paremmin. Lisäksi tämän tiedon avulla viljely-ympäristö voitaisiin optimoida solujen tarpeiden mukaiseksi ja sen seurauksena pidentää niiden elinkaarta ja funktionaalisuutta.

Tämän väitöskirjatyön päätavoitteina oli ensin tutkia lipidi- ja rasvahappoprofiilien muutoksia maksasolujen erilaistumisen aikana ja pyrkiä tunnistamaan tässä erilaistumisessa ja kypsymisessä tärkeitä lipidejä. Tätä tarkoitusta varten tehtiin yksityiskohtainen lipidomiikka-analyysi ja rasva-aineenvaihduntaan osallistuvien avaingeenien ilmentymisen profilointi useina eri ajankohtina erilaistumisprosessin aikana. Toinen tavoite oli kuvata kattavasti kantasoluista tuotettujen maksasolujen lipidi- ja rasvahappoprofiili ja verrata sitä tämänhetkisiin standardimaksasolumalleihin. Maksasolujen tuottamiseen iPS-soluista käytettiin viittä eri menetelmää ja näiden maksasolujen lipidiprofiili samoin kuin niiden kyky syntetisoida ja prosessoida rasvahappoja tutkittiin perusteellisesti ja verrattiin laajasti käytettyihin maksasolumalleihin. Lisäksi tarkasteltiin kunkin menetelmän avulla tuotettujen erilaisten kasvatusolosuhteiden vaikutusta solujen ilmiasuun sekä toiminnallisuuteen. Kolmas tavoite keskittyi maksasolujen dedifferentiaation, eli soluviljelmissä tapahtuvan maksasoluominaisuuksien menettämisen, taustalla olevien mekanismien tutkimiseen seuraamalla ihmisen maksasta eristettyjen solujen lipidiprofiilin muutoksia soluviljelyn aikana. Lipidomiikka-analyysista saatuja tuloksia täydennettiin mikroRNA-analyysillä, jotta voitiin tunnistaa eri tavoin ilmentyneet mikroRNA:t, jotka voisivat säädellä tuota prosessia.

Yhteenvetona voidaan todeta, että iPS-soluista tuotetut maksasolut tarjoavat asianmukaisen ja toimivan solumallin ihmisen rasva-aineenvaihdunnan tutkimiseksi sekä solu- että molekyylitasolla. Lisäksi tämä tutkimus tarjoaa uusia havaintoja lipidien, rasvahappojen ja mikroRNA:n mahdollisesta roolista differentiaatio- ja/tai dedifferentiaatioprosessissa, joita voidaan soveltaa kantasoluista tuotettujen maksasolujen kypsymistä parantavien viljely-ympäristöjen suunnittelussa. Koska maksasolut menettävät soluviljelmissä merkittäviä metabolisia toimintojaan suhteellisen nopeasti, tämä tutkimus tarjoaa uusia ideoita ja strategioita kasvatusjärjestelmien parantamiseksi maksasolujen pitämiseksi toiminnallisina pitkäaikaisissakin soluviljelmissä.

Primary human hepatocytes (PHHs) are currently considered the “gold standard” cell model for investigating the liver physiology, toxicity, and lipid homeostasis. However, PHHs are scarce and functionally heterogeneous, and when cultured, they lose their liver-specific functions relatively fast within a few days. Induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells (iPSC-HLCs) provide a relevant alternative model for PHHs to study the lipid derangements of the liver. Unlike PHHs, the cell source to generate iPSC-HLCs is unlimited and they can be advantageously generated from selected individuals with different genetic backgrounds. Since lipid defects play central roles in the pathogenesis of several common diseases such as non-alcoholic fatty liver disease and atherosclerotic cardiovascular disease, iPSC-HLCs could serve as a novel platform for studying the basic mechanisms of the lipid metabolism and its dysregulation in a truly patientspecific manner. Additionally, this cell model could be utilised in drug discovery and especially in studying the drug induced hepatotoxicity. To maximise the utilisation of HLCs for such valuable purpose, it is critical to characterise their detailed lipid profile in relation to the human adult liver cells.

Lipids are a major class of molecules, which play critical roles in cellular structure, function, and signalling. It has been shown that certain fatty acids (FAs) promote neuronal and adipocyte differentiation. Therefore, in-depth knowledge of changes in lipid and FA profile of the hepatocytes during differentiation and dedifferentiation could assist us to generate matured target cells, which resemble the lipid profile of PHHs even closer. In addition, this knowledge can be utilised to optimise the culture environment according to the cellular need and subsequently prolong the life span and functionality of both the iPSC-HLCs and the PHHs in Culture.

Major aims of this thesis were to first study the alterations in the lipid and FA profile of the cells during the hepatic differentiation in order to identify the lipid species that may play important roles in the differentiation and maturation of hepatocytes. For this purpose, detailed lipidomic analysis and gene expression profiling of a set of key genes involved in the metabolism of lipids were performed at several time points during the entire differentiation process from iPSC to HLCs.

The second aim was to comprehensively characterise the lipid and FA profile of HLCs against current standard hepatic cell models. HLCs were generated by five different methods and their lipid profile as well as their ability to synthesise, elongate, and desaturate FAs were thoroughly assessed and compared to the profiles of widely used hepatocyte models, PHHs and HepG2 cells. In addition, the effect of various conditions or stimuli introduced by each method were evaluated on HLCs’ phenotype and functionality. The third aim focussed on the mechanisms behind the hepatic de-differentiation by studying the alterations in the lipid profile of the PHHs during their prolonged two-dimensional (2D) culture. In addition, we complemented our results from lipidomics with miRNA analysis to further identify the differentially expressed miRNAs that may regulate changes in the lipid profile of PHHs during the process of de-differentiation.

Taken together, our findings illustrate that HLCs differentiated from iPSCs provide a relevant and functional cell model to explore human lipid homeostasis at both cellular and molecular levels. Additionally, this thesis provides novel findings on the possible role of lipids, FAs, and miRNAs in the process of differentiation and/or de-differentiation and may be applied in designing culture environments that would improve the maturity of HLCs. Since hepatocytes in 2D culture lose their metabolic competence and viability relatively fast, this thesis offers some new ideas and strategies to improve the culture systems for maintaining hepatocytes in longterm culture.