Mechanobiology in Health and Disease : Exploring Talin’s mechanobiology with computational modeling and simulation techniques

Abstract

Kaikki elävät organismit vastaanottavat mekaanisia viestejä ympäristöstään. Kyky vastaanottaa mekaanisia signaaleja ja erityisesti yksittäisten solujen kyky reagoida mekaanisiin viesteihin ovat keskeisen tärkeitä elintoiminnoille. Mekaanisten viestien vastaanottamista tapahtuu kaikissa solu- ja kudostyypeissä aina erilaistuvista soluista jo pitkälle erilaistuneisiin soluihin. Ei siten yllätä, että yhä useampia mekanoviestintään liittyviä solujen rakenneosasia on liitetty erilaisiin sairauksiin.

Tarve ymmärtää sairauksia ja niiden alkuperää, hoitaa niitä ja ylipäänsä parantaa elämänlaatua on johtanut laajamittaiseen tiedon hankkimiseen ja uusien keksintöjen syntymiseen useilla eri tieteenaloilla. Nykyaikainen monitieteinen tutkimus tuottaa valtavan määrän informaatiota. Tämä väitöskirja keskittyy solun rakenteiden tarkasteluun mekanoviestinnän näkökulmasta. Pyrin tarkastelemaan mekanoviestinnän ja sairauksien yhteyksiä kokonaisvaltaisen lähestymistavan avulla, jossa huomioidaan solun rakenne, proteiinien tunnetut rakenteet, proteiinien jo tunnetut yhteydet sairauksiin, molekyylien keskinäiset vuorovaikutukset ja mekanotransduktion mahdollistavat, useista molekyyleistä koostuvat rakenteelliset kokonaisuudet.

Tarkastelen yksityiskohtaisemmin taliini-proteiinin rakenteen säätelyä mekaanisten viestien toimesta. Laajennan tarkastelua α-helikaalisten proteiinien toimintaan, tarkastellen erityisesti vinkuliinin ja α-kateniinin rakennetta. Taliinin ja vinkuliinin yhteyttä ateroskleroosiin tutkittiin vertailemalla proteiinien ekspressiotasoja sairaissa ja terveissä verisuonissa käyttäen microarray-tekniikkaa ja kvantitatiivista reaaliaikaista PCR-tekniikkaa. Taliini- ja vinkuliinigeenien havaittiin olevan vähemmän ekspressoituja ateroskelroottisissa plakeissa verrattuna terveisiin verrokkikudoksiin. Vertailimme myös stabiilien ja epästabiilien plakkien ekspressiotasoja, joissa havaittiin heikko negatiivinen korrelaatio taliini- ja vinkuliiniekspression ja plakin vakavuuden välillä, joka ei kuitenkaan tilastollisessa testauksessa tuottanut selkeää eroa. Tulokset viittaavat siihen, että alentunut kudoksen mekaaninen kestävyys heikentää kudosvaurioiden korjautumista ja repeytymien paranemista, johtaen epästabiilien ateroskelroottisten plakkien syntymiseen. Tämä tutkimus on ensimmäinen, joka osoittaa taliinin ja vinkuliinin tärkeän roolin ateroskeleroosin kehittymisessä.

Huolimatta siitä, että α-helikaaliset proteiinit ovat yleisiä proteomissa ja ne epäilemättä ovat hyvin merkityksellisiä terveyden ylläpitämisessä ja sairauksien synnyssä, niiden rakenteellinen käyttäytyminen mekaanisen rasituksen alla tunnetaan huonosti. Tämän lisäksi on huomioitavaa, ettei sitä, miten solut tunnistavat mekaanisia signaaleja ja kuinka mekaaniset signaalit vaikuttavat solujen toimintaan tunneta hyvin. Tämän vuoksi tässä työssä tarkasteltiin taliini-proteiinin käyttäytymistä mekaanisen rasituksen alaisena. Käytimme monitieteistä lähestymistapaa, jossa yhdistettiin laskennallinen molekyylidynamiikka (MD) ja suunnattu (engl. steered) molekyylidynamiikka (SMD) kokeelliseen yhden molekyylin atomivoimamikroskopiatekniikkaan (smAFM) ja solujen avulla tehtäviin kokeisiin sekä biokemiallisiin analyyseihin.

Käyttämällä laskennallisen biologian avulla suunniteltuja mutaatioita, näytimme, että taliinin rod-domeenin aladomeenin R3 heikentäminen vähentää solun supistumiskykyä. Taliinin ja vinkuliinin havaittiin kertyvän fokaaliadheesioiksi kutsuttuihin solun hienorakenteisiin niin, että niiden sitoutuminen oli dynaamisempaa ja lopputuloksena oli taliinirikkaita, mutta epävakaita adheesiorakenteita. Havaitsimme myös yhteyden taliinin kestävyyden ja solun migraationopeuden välillä. Lisäksi huomasimme, että taliinin heikentäminen vaikuttaa siihen, että miten solu käyttää eri integriinityyppejä. Lyhennetyillä taliinin muodoilla tehdyt kokeet tukevat R3 aladomeenin mekanosensorista roolia. Kokonaisuutena tämä tutkimus osoitti, että taliinin rod-domeenin aladomeenien laskostumisen avautuminen on keskeinen solu-sidekudos adheesioiden rakentumisen säätelijä. Saimme myös lisää vahvistusta taliinin merkityksestä solun migraatiossa ja ympäristön tunnistamisessa.

Väitöskirjan osatyö Haining ym. osoitti, kuinka koko taliinin rod-domeeni on mahdollisesti mekaanisten signaalien kontrolloima. Havaitsimme, että aladomeenien avautuminen tapahtuu jo 10-40 pN voiman ansiosta, joka on samaa luokkaa kuin mitä yksittäisiin proteiineihin kohdistuva voima on elävissä soluissa. Kokeet smAFM:n avulla yhdistettyinä SMD-simulaatioihin osoittivat, että taliiniin rod-domeenin aladomeenien mekanostabiilisuus vaihtelee. Näiden tulosten perusteella voidaan esittää mekanismi, jossa taliinin rod-domeeni toimii solussa mekanosensorina, ja välittää aladomeenien purkautumisen avulla eteenpäin signaaleja, joiden avulla solu voi reagoida ympäristönsä olosuhteisiin.

Väitöskirjan viimeisessä osatyössä tarkasteltiin taliinin ja α-kateniinin käyttäytymistä mekaanisen rasituksen alla. SMD-simulaatiot osoittivat, että nämä proteiinit purkautuvat stabiilin 3-heliksiä käsittävän välimuodon kautta. Vaikka taliinin 5-heliksi aladomeenit ovat mekaanisesti kestäviä, on mahdollista, että kolmen heliksin välimuoto syntyy aladomeenin aukipurkautumisen ansiosta. Heikompien 4-heliksi aladomeenien havaittiin purkautuvan helposti 3-heliksi tilaan, mikä on niiden mekaanisesti vahvin olomuoto. Simulaatiotulokset varmistettiin kokeellisesti suunnittelemalla disulfidisidoksia, jotka estävät 3-heliksi -tilan purkautumisen. Näiden aukipurkautumisen välimuototilojen biologisen merkityksen tarkempi selvittäminen vaatii jatkotutkimuksia. Proteiinien mekaanisen aukilaskostumisen parempi ymmärtäminen on askel kohti kokonaisvaltaista mekanosignaloinnin ymmärtämistä, mikä auttaa sekä solun normaalin toiminnan hahmottamisessa että sairauksien mekanismien selvittämisessä ja niiden hoitojen kehittämisessä.

All living organisms are continuously exposed to mechanical forces that are exerted on them by their surroundings. The ability of organisms, and more importantly, the ability of individual cells to receive mechanical signals and respond to the stimuli, is fundamental to life. Mechanosensing is present in all cell and tissue types from differentiating to highly differentiated units. Thanks to the variety of roles and cellular components it is not surprising that a vast variety of diverse diseases has been and is continuously being recognized as diseases of mechanotransduction.

The need to define disease symptoms, to discover their causes, to cure illnesses or to increase the quality of life has accumulated significant amount of knowledge and led to discoveries and inventions in various scientific fields. The intensive research is constantly providing enormous amount of multidisciplinary information. In this thesis, I target the subcellular and protein structures that are implicated in mechanotransduction and their known connection to a disease. I provide a comprehensive overview of the known cellular and structural data, disease connection, interactions and mechanotransduction pathway associations.

Further in the work, I focus on the mechanosensitivity of talin protein together with other α-helical proteins, in particular vinculin and α-catenin. The disease association of talin and vinculin expression is investigated in atherosclerosis and plaque formation with microarray analysis (MA) and qRT-PCR low-density array. All the analyzed talin and vinculin genes are significantly and consistently downregulated in atherosclerotic plaques compared to healthy control. The differences in expression levels between stable and unstable plaques are found statistically insignificant. Nonetheless, a negative tendency in the protein expression in unstable plaques is observed. This investigation shows for the first time the involvement of talin and vinculin in atherosclerosis. It suggests that impaired tissue mechanostability affects the tissue remodeling and healing capabilities leading to development of unstable plaques.

Despite the abundance of α-helical folds among the proteome and their undeniable relevance in health and disease, the fundamental principles of their behavior under mechanical load are poorly understood. Furthermore, it is still not fully known how cells sense and interpret mechanical forces and how they drive their mechanical response. In the following, talin mechanosensitivity is investigated in a multidisciplinary research combining computational molecular dynamics (MD) and steered molecular dynamics (SMD) simulation with single-molecule atomic force microscopy (smAFM) and cellular experiments supported by biochemical analysis.

Utilizing computationally designed mutations we show that destabilization of the talin rod R3 subdomain decreases cellular traction force generation. Decreased force traction modifies the dynamics of talin and vinculin in focal adhesions and results in a formation of talin-rich yet unstable adhesions. We also report a link between talin mechanostability and cell migration rate. Finally, talin destabilization leads to involvement of different integrin subtypes and sensing of extracellular matrix (ECM) proteins. Experiments with truncated forms of talin confirm the mechanosensory role of the talin R3 subdomain. This study provides clear evidence of how talin rod subdomain unfolding acts as a key regulator in focal adhesion and in the adhesion formation. Additionally, this research confirms the central role of talin rod in cellular processes such as cell migration and substrate sensing.

Secondly, we show that the entire talin rod can be unfolded by mechanical force. Such unfolding occurs under a physiological range of forces between 10 and 40 pN. We also demonstrate, through a combination of smAFM and SMD, that the different subdomains within the talin rod display a specific hierarchy of mechanostability. These results provide a mechanism by which different force conditions within the cell control gradual unfolding of the talin rod, modify talin interactions, and result in a finely tuned cellular response to applied forces.

Finally, we investigate unfolding of talin and α-catenin proteins. SMD simulations reveal that talin and α-catenin α-helical subdomains unfold through a stable 3-helix conformation. Even though the talin 5-helix subdomains are mechanically stable folds, a second stable conformation representing the 3-helix state is detected in force induced unfolding. Also mechanically weaker 4-helix subdomains unfold into a mechanically stable 3-helix state. Specifically designed mutants, utilizing disulfide clamps to protect the stable state, support the intermediate model in both computational and experimental setups. The unfolding intermediate was recognized in talin and α-catenin subdomains, yet the biological significance of this stable state remains unclear. Better understanding of similar fundamental principles of mechanical unfolding mechanisms could be a major step towards comprehensive mechanoregulation models in health and in disease.