Functionality of Brain in a Dish : Methods and study of electrophysiological phenomena in human pluripotent stem cell-derived neural networks

Abstract

Ihmisaivot koostuvat sähköisesti aktiivisista verkostoista. Nämä verkostot ovat aivotoimintamme perusta ja ne saavat alkunsa jo ennen syntymää. Aivojen kehityksen aikana ensimmäiset verkostot muodostuvat yksittäisistä hermosoluista. Samaan aikaan aivojen rakenne ja sähköinen toiminta muuttuvat vaiheittain. Emme kuitenkaan täysin ymmärrä kuinka yksittäisten hermosolujen toiminta johtaa aivotoimintaan. Tätä voidaan tutkia laboratoriossa, kasvattamalla hermosoluja ihmisperäisistä kantasoluista. Näin kasvatetut hermosolut muistuttavat ominaisuuksiltaan hermosoluja, joita voidaan löytää kehittyvistä aivoista eri vaihessa. Tämän lisäksi ihmisperäisistä kantasoluista tuotetut hermosolut kykenevät tuottamaan sekä yksittäin, että verkostona sähköistä aktiivisuutta.

Tämän väitöskirjan tavoitteena oli tutkia tarkemmin miten ja millaista sähköistä aktiivisuutta ihmisperäisistä kantasoluista kasvatetuissa hermoverkoissa muodostuu ja näin auttaa meitä tulevaisuudessa ymmärtämään kuinka aivotoiminta muodostuu terveissä ja sairaissa aivoissa. Tavoitteena oli myös selvittää eroja ihmisen ja eläinten aivotoiminnan kehittymisen välillä. Jotta hermosolujen kehittyviä sähköisiä ominaisuuksia voitiin seurata samaan aikaan kun mitattiin laajemman verkoston ominaisuuksia, kehitettiin väitöskirjassa uusia koe- ja analyysityökaluja.

Tässä väitöskirjatyössä varmistettiin ensin, että ihmisperäisistä kantasoluista kasvatetut solut todellakin olivat hermosoluja. Tämä suoritettiin tarkastelemalla solujen muotoa, sekä niissä esiintyviä proteiineja. Tämän lisäksi hermosolujen ja hermoverkkojen sähköistä aktiivisuutta ja sen kehittymistä seurattiin. Seuraaminen toteutettiin mittaamalla sähköistä aktiivisuutta useasta hermosolusta samaan aikaan mikroelektrodihilalla (MEA) tai kuvaamalla tiheään kalsiumionipitoisuusherkällä väriaineella värjätyä hermoverkkoa (kalsiumkuvannus). Yksittäisten hermosolujen solukalvon sähkönjohtavuuden muutoksia mittattiin solun sisään asetettavalla elektrodilla (patch clamp). Hermosolujen aktiivisuusmittausten tehostamiseksi, selvitettiin kasvattaako hermosolujen kasvupinta-alan ja nestetilavuuden rajoitus mittausherkkyyttä. Sähköisen toiminnan muodostumista tarkisteltiin yhdistämällä MEA-mittaukset ja kalsium-kuvannukseen, jotta voitaisiin selvittää kuinka yksittäisten hermosolut toimivat suhteessa verkoston toimintaan. Lisäksi verkostoja altistettiin erilaisille toimintaa häiritseville aineille, jotta saataisiin tarkempaa tietoa siitä mitkä hermosolujen ominaisuudet ovat kriittisiä koko verkoston toiminnan kannalta. Väitöskirjatyön aikana kehitettiin ja testatiin uusia analyysiohjelmistoja, jotta voitaisiin tarkemmin erotella sähköistä aktiivisuutta MEA elektrodien mittaamasta signaalista, ja jotta voitaisiin automaattisesti tunnistaa ja päätellä kalsiumkuvannuksen tuottamista kuvasarjoista yksittäisten hermosolujen ja verkoston aktiivisuutta.

Hermosolujen kasvupinta-alan ja nestetilavuuden rajoituksen havaittiin lisäävän mittauksissa näkyvää aktiivisuutta. Avuksi kehitetyt analyysiohjelmistot mahdollistivat toisiaan täydentävän datan tuottamisen yhtäaikaisista MEA- ja kalsium-kuvannusmittauksista. Lisäksi sähköisen aktiivisuuden ja häiritsevien aineiden vaikutuksien tarkastelu paljasti ihmisperäisille hermoverkoille ominaisia piirteitä, mutta myös piirteitä, joita on havaittu muiden eliöiden aivojen kehityksen aikana.

Loppupäätelmänä voidaan sanoa, että ihmisperäististä kantasoluista kasvatetut hermoverkot ja kehitetyt mittaus- ja analyysityökalut muodostavat kokonaisuuden, joka tulevaisuudessa mahdollistaa aivoaktiivisuuden ja siihen vaikuttavien tekijöiden takana olevien yksityiskohtien selvittämisen.

The brain consists of electrically active circuits that carry out the functions of human cognition. These circuits are formed during development via structural and functional brain development. Our understanding of how the functional aspect arises from the cellular components remains incomplete. In vitro neuronal networks derived from human pluripotent stem cells (hPSCs) can be harnessed to repeat several key steps of structural brain development. Furthermore, hPSC-derived neurons are able to capture the development of functionality on an individual level and have been shown to display features of network activity.

The aim of this thesis was to aid the understanding of human specific cellular physiology underlying network activity formation during neural development and generation of abnormal brain functions by studying the spontaneous emergence of network activity patterns in hPSC-derived neural networks. For studying the immature physiological properties of hPSC-derived neurons in the context the emerging network activity patterns, new experimental and analytical tools were developed.

In this thesis, hPSC-derived neural networks were characterized on morphological and molecular levels to ensure the generation of neural cells. Furthermore, the emergence of network activity patterns and the underlying single neuron activity was investigated with microelectrode arrays (MEAs), calcium imaging and patch-clamp technique. To enhance the recordings of neural activity the effects of area and volume restriction by microfluidic devices were investigated. To assess the physiological properties of single neurons in the context the emerging network activity patterns, calcium imaging was combined with MEA measurements while performing pharmacological manipulations. Furthermore, new analytical tools for improving activity detection on MEAs and for collecting large scale single cell activity data from calcium imaging were developed and tested.

The activity measurements of hPSC-derived neural networks were found to be improved by restricting the growth area and volume. The developed analysis methods allowed two powerful measurement methods to be combined, providing improved temporal and spatial resolution. Furthermore, the hPSC-derived networks were found to recapitulate general as well as species-specific features and mechanisms of network activity pattern development.

In conclusion, hPSC-derived networks in combination with the developed tools will be a valuable system for unraveling the detailed mechanisms of the formation of abnormal brain functions in the future studies.